程爽爽，張 姣，杜雙田

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

自古以來，香菇[Lentinus edodes（Berk.）Sing.]就有著“山珍之王”、“植物性食品的頂峰”等美譽，不僅營養(yǎng)豐富，還具有降低膽固醇，預(yù)防心血管疾病、糖尿病、佝僂病。

隨著人民生活水平的提高及保健意識的增強，香菇的市場需求量逐年增大。截止目前，我國已有“慶元香菇”、“隨州香菇”、“西峽香菇”、“平泉香菇”4個地理標(biāo)志香菇產(chǎn)品，基本形成了以“慶元香菇”產(chǎn)地為核心區(qū)域的浙江、以“隨州香菇”產(chǎn)地為核心區(qū)域的湖北、以“西峽香菇”產(chǎn)地為核心區(qū)域的河南、以“平泉香菇”產(chǎn)地為核心區(qū)域的河北的4大產(chǎn)區(qū)。

香菇菌種在香菇產(chǎn)量及品質(zhì)構(gòu)成中占有十分重要的位置，尤其在以自然生態(tài)環(huán)境和傳統(tǒng)農(nóng)藝方式為基礎(chǔ)發(fā)展起來的我國香菇產(chǎn)業(yè)中，優(yōu)良菌種在產(chǎn)業(yè)發(fā)展所占的技術(shù)份額起到舉足輕重的作用。我國之所以能在幾年時間迅速發(fā)展為產(chǎn)量居世界第一的食用菌生產(chǎn)大國，除了因地制宜地采用適合中國國情的栽培體系和栽培方式以外，重視引進(jìn)及選育適合我國栽培特點的優(yōu)良菌種無疑也是一個重要因素。

我國香菇產(chǎn)量占食用菌總產(chǎn)量的70%。但在香菇的育種方面，與先進(jìn)國家相比還有一定的差距。我國香菇的育種經(jīng)歷了起步階段、引種階段、單孢雜交育種階段及原生質(zhì)體技術(shù)選育菌種4個階段[1]，主要方法有人工選擇育種、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種、分子標(biāo)記輔助育種等。其中，雜交選育是目前選育香菇新品種最有效的方法[2]。香菇的雜交育種是利用香菇的擔(dān)孢子有不同“性”的特性，選擇不同優(yōu)良親本的單核菌株進(jìn)行配對雜交以實現(xiàn)基因重組，綜合其兩親本的優(yōu)良性狀，克服親本原有的不良性狀，從而育成符合人們需要的、具有雜種優(yōu)勢的新品種。在雜交育種中，選擇優(yōu)良單核菌株是獲得優(yōu)良雜交株的關(guān)鍵，但關(guān)于單核菌株生長特性的研究甚少。

本研究通過分析香菇不同品種單核菌株的菌絲生長速率、菌落類型頻率分布、菌落長勢評分等指標(biāo)以及低溫保藏對單核菌株生長的影響，比較不同香菇品種單核菌株生長性狀的差異性，以期為香菇雜交選育的材料選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品種

供試品種見表1。

表1 供試品種編號及其來源Tab.1 Test varieties and their sources

1.1.2 綜合PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、蛋白胨2 g、酵母浸粉 2 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂粉12 g，水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 單核菌株的獲取

參照參考文獻(xiàn) [3]，將單孢分離獲得的單菌落菌株接至綜合PDA平板，培養(yǎng)10 d，經(jīng)插片鏡檢，菌絲上無鎖狀聯(lián)合即為單核菌株，即為研究材料。

1.2.2 單核菌株菌絲生長速率測定

將上述單核菌株轉(zhuǎn)接至綜合PDA平板，在（25±1）℃培養(yǎng)12 d，沿菌落邊緣用直徑5 mm的無菌打孔器取其菌餅再轉(zhuǎn)接在綜合PDA平板中央，記錄菌絲萌發(fā)時間，采用十字劃線法[4]測定菌絲生長速率（S，mm·d-1）公式為：

式中：D為菌落平均直徑（mm），T為培養(yǎng)天數(shù)（d）。

1.2.3 菌落長勢評分

根據(jù)單核菌株菌落的潔白程度、氣生菌絲的疏密及旺盛程度等將試驗菌落分為5組（優(yōu)、良、中、較差、差），從差到優(yōu)依次給1分~5分，不萌發(fā)菌株的長勢評分為0。

1.2.4 菌落類型

在綜合PDA平板培養(yǎng)中，單核菌絲較纖細(xì)，分枝少，菌絲生長速率緩慢。菌落形態(tài)可歸納為4種類型[5]：疏松型（A）、致密型（B，與雙核菌絲菌落相似）、貼生不均勻型（C）、貼生均勻型（D），如圖1所示。分別統(tǒng)計不同品種的單核菌株不同菌落類型的分布情況。

圖1 單核菌株菌落的類型Fig.1 Colony types of monokaryons strains

1.2.5 低溫保藏對單核菌株菌絲生長情況的影響

選取4℃低溫保藏3個月的單核菌株，在綜合PDA培養(yǎng)基上活化2次，依據(jù)方法1.2.2轉(zhuǎn)接綜合PDA平板，統(tǒng)計菌絲萌發(fā)時間，測定菌絲生長速率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 20進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢分離及單核菌株鑒定

分離鑒定結(jié)果見表2。

表2 不同品種單孢分離及單核菌株數(shù)量統(tǒng)計Tab.2 Number of single colonies and number of monokaryons in different strains

由表2可見，研究中挑取的單菌落較多，但得到的單核菌株有限，表明孢子在無菌水中的分散性較差，部分孢子沒有完全分開，在今后的研究中可在制備無菌水時添加一定的表面活性劑，使孢子充分分散，以取得更好的分離效果。

2.2 單核菌株菌絲生長速率比較

不同品種單核菌株的菌絲生長速率測定結(jié)果見表3和圖2。

表3 不同品種單核菌株的菌株生長速率Tab.3 Mycelium growth rates of monokaryonsin in different varieties

圖2 不同品種單核菌株菌絲生長速率頻率分布Fig.2 Distribution on mycelium growth rates of monokaryons in different varieties

由表3可見，不同品種的香菇，其單核菌株的菌絲生長速率差異顯著。其中，L-02的單核菌株菌絲生長速率最小，為0.77 mm·d-1；0912的單核菌株生長速率最大，為2.02 mm·d-1，是L-02的單核菌株的2.62倍；二者的單核菌株菌絲生長速率均與其它品種的差異顯著。標(biāo)準(zhǔn)差的大小反映了同一品種不同單核菌株菌絲生長速率差異情況，標(biāo)準(zhǔn)差越大，表明不同單核菌株生長速率差異越大?？梢钥闯觯n香的單核菌株生長速率差異最大，L-02的單核菌株生長速率差異最小。

由圖2可知，供試品種單核菌株生長速率分布接近正態(tài)分布，但不同品種的分布圖形態(tài)差異較大，表明不同品種的單核菌株生長速率差異程度不同。圖2Ⅰ中，L-02所有單核菌株生長速率均不超過1.50 mm·d-1，主要集中于 0.50 mm·d-1～1.00 mm·d-1，該品種不同單核菌株的生長速率差異性小，且生長速率小，與表3結(jié)果相同。韓香、K95-1、K95-2、K95-5、永豐1號的單核菌株生長速率分布較分散，表明該品種單核菌株生長速率差異性較大。圖2Ⅳ所示的3個品種，即段木1號、9319和0912，生長速率在0～1.50 mm·d-1之間的單核菌株很少，3個品種的單核菌株生長快的居多，平均生長速率高于其他品種。

2.3 單核菌株菌落長勢評分比較

單核菌株菌落長勢評分比較見圖3。由圖3可見，供試品種的單核菌株菌落長勢評分頻率分布接近正態(tài)分布，且集中分布在3分區(qū)域，分布頻率均在40%以上。表明香菇的單核菌株菌落長勢接近均值的居多，長勢差的單核菌株數(shù)量相對較少。供試品種中大部分品種單核菌株菌落長勢相對較好。僅在L-02、康源3號、靈仙1號、段木1號4個品種中，有少部分單核菌株的菌落長勢差，但其數(shù)量均不超過總樣本的6%。靈仙1號和永豐1號單核菌株菌落長勢較差的較多，分別為總樣本數(shù)的16.98%和16.13%。0912單核菌株菌落長勢中等的最多，分布頻率為77.19%。段木1號和武香1號菌落長勢良好的單核菌株較多，分布頻率分別為31.53%、31.25%。永豐1號菌落長勢優(yōu)秀的單核菌株最多，分布頻率為16.13%。

圖3 不同品種單核菌株菌落長勢評分頻率分布Fig.3 Distribution on colony growth scores of monokaryons in different varieties

圖4 不同品種單核菌株菌落類型分布Fig.4 Distribution on colony types of monokaryons in different varieties

2.4 不同單核菌株菌落類型分布分析

不同單核菌株菌落類型分布分析見圖4。

由圖4可知，不同香菇品種單核菌落類型分布差異較大。在4種類型中，疏松型單核菌株分布頻率差異最大，其中L-02中疏松型單核菌株占86.76%，段木1號中疏松型僅占9.48%，相差9.15倍；致密型單核菌株分布頻率差異次之，其中段木1號中致密型單核菌株占49.14%，L-02中致密型占5.88%；貼生均勻型單核菌株菌落類型差異更小，其中康元3號中貼生均勻型的單核菌株分布頻率最大為36.17%，L-02的最小為2.94%；貼生不均勻型單核菌株分布頻率差異最小，靈仙1號貼生均勻型的單核菌株分布頻率最大為32.08%，L-02的最小為4.41%；同一品種的單核菌株菌落4種類型的分布頻率也存在一定差異性，韓香差異最?。?0.59%~32.35%），L-02差異性最大（2.94%~86.76%）。

2.5 低溫保藏對單核菌株菌絲生長的影響

2.5.1 低溫保藏對單核菌株萌發(fā)期的影響

低溫保藏對單核菌株萌發(fā)期的影響見圖5。

圖5 低溫保藏3個月單核菌株萌動期分布頻率Fig.5 Distribution on germination time of monokaryons

供試單核菌株未低溫保藏前其萌動期差異均在24 h內(nèi)萌發(fā)。由圖5可知，保藏后的單核菌株萌動期從24 h到132 h不等，低溫保藏3個月以后，大部分菌株的萌動期延長。不同品種單核菌株萌動期分布頻率差異很大，但都接近正態(tài)分布。圖5Ⅰ中，段木1號、K95-1、武香1號單核菌株低溫保藏后24 h內(nèi)均不萌發(fā)（從圖5Ⅰ中看出，3個品種的單核菌株在24 h~36 h范圍內(nèi)均有萌發(fā)），其他品種24 h內(nèi)有少量單核菌株萌發(fā)，其中0912最多，為總數(shù)的12.90%。0912、K95-1、K95-2的單核菌株在36 h左右萌發(fā)較多，段木1號、武香1號、L-02、9319、韓香、靈仙1號、秋栽7號的單核菌株在60 h左右萌發(fā)的較多。圖5Ⅰ中，段木1號、興化2號、K95-5少數(shù)單核菌株的萌動期為132 h，是低溫保藏前萌動期的5.5倍。總體而言，低溫保藏3個月使得大部分單核菌株萌動期延長，表明低溫保藏可導(dǎo)致單核菌株的活力下降。

2.5.2 低溫保藏對單核菌株菌絲生長速率的影響

不同品種單核菌株低溫保藏后的菌絲生長速率情況見表4。

表4 不同品種單核菌株低溫保藏后的菌絲生長速率Tab.4 Mycelium growth rates of monokaryons in different varieties after cryopreservation

由表4可見，3個月的低溫保藏期對單核菌株的生長速率影響很大。L-02的單核菌株的菌絲生長速率顯著提高，是未保藏前的1.15倍。秋栽7號單核菌株的生長速率沒有受到影響。其余品種單核菌株的生長速率均有降低。其中，段木1號的下降率為52%，其次為武香1號及9319，再次為K95-5和K95-1等。由此可見，大部分香菇品種的單核菌株不宜長期低溫保藏，在單孢分離之后立即進(jìn)行雜交，以免影響雜交效果。

3 討論

3.1 不同香菇品種單核菌株生長速率間差異顯著

從結(jié)果分析看出，供試13個品種單核菌株菌絲生長速率差異顯著。0912的單核菌株生長速率最高到達(dá)（2.02±0.48） mm·d-1，L-02的單核菌株菌絲生長速率最低為（0.77±0.19） mm·d-1。因為品種不同，其遺傳物質(zhì)必然不同，菌絲生長速率有一定差異。因此在選擇單核菌株時不能一味地選擇菌絲生長快的菌株，林范學(xué)等[6]育種時發(fā)現(xiàn)，菌絲生長太快的菌株，基質(zhì)營養(yǎng)消耗過快，香菇的產(chǎn)量不高，產(chǎn)量主要集中在第一潮、第二潮菇。Gong等[7]對157個香菇單孢單核體的生長速度等性狀進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)菌絲生長速度、生物量、萌發(fā)時間呈現(xiàn)連續(xù)變異，屬多基因控制，生長速度與生物量呈正相關(guān)，萌發(fā)時間與生長速率、生物量呈負(fù)相關(guān)。

3.2 同一品種單核菌株菌絲生長速率分布頻率不同

同一香菇得到的單核菌株菌絲生長速率間有較大差異，其生長速率的分布頻率呈正態(tài)分布，表明同一子實體所產(chǎn)生的孢子其遺傳因子有一定差異，擔(dān)孢子間有較大的選擇性。從頻率分布的標(biāo)準(zhǔn)差來看，其選擇差不同。潘迎捷等[8]研究發(fā)現(xiàn)，同一來源的香菇單核菌株之間存在酯酶同工酶等酶的多型性，表明同一來源單核菌株遺傳物質(zhì)差異較大。因此采用單孢分離雜交選育是提高菌株生產(chǎn)性能的重要途徑。

3.3 單核菌株菌落長勢評分符合正態(tài)分布

菌落長勢是在菌種選擇中使用的一個綜合性概念，是菌落大小、白度、菌絲旺盛程度等指標(biāo)的一個綜合指標(biāo)。菌落長勢評分符合正態(tài)分布表明大部分菌株的生長情況集中在平均數(shù)附近，表現(xiàn)差的和優(yōu)秀的僅占少數(shù)，表明以菌落長勢為指標(biāo)選擇菌株時，必須有足夠的樣本數(shù)量。

3.4 不同品種單核菌株菌落類型分布頻率不同

同一朵香菇的單孢子有4種類型，在分離培養(yǎng)中，單孢子萌發(fā)的單核菌株在綜合PDA培養(yǎng)基上生長特征不同，分成疏松型、致密型、貼生不均勻型、貼生均勻型4種類型目的是選擇不同類型的單核菌株雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的香菇品種中，單核菌株的4種類型所占比例并不一致。在供試品種中，品種9319、L-02和秋栽7號的疏松型單核菌株所占比例較高，分別達(dá)到69.49%、86.76%和72.22%，其他類型所占比例相應(yīng)的就較少。韓香、康源3號、靈仙1號3個品種中4種類型的比例接近。因此，從單核菌株的菌落類型選擇雜交組合也有一定的局限性。按照經(jīng)典遺傳學(xué)原理，香菇為四極性異核結(jié)合，孢子的4種類型不能完全從菌落的生長特性上反映出來。程水明和林范學(xué)[9]的研究結(jié)果表明，香菇中擔(dān)孢子交配型因子分離偏離理論預(yù)期，偏離程度栽培菌株大于野生菌株。張小雷等[10]認(rèn)為，單核菌絲挑取的時間導(dǎo)致生長極慢的菌株丟失，進(jìn)一步造成偏分離現(xiàn)象。所以試驗中挑取單菌落的時間可能會導(dǎo)致孢子萌發(fā)極慢的菌株丟失，使得菌落類型分布出現(xiàn)偏差，需要調(diào)整挑取單菌落的時間進(jìn)行進(jìn)一步的試驗驗證。

3.5 單核菌株不宜低溫長時間保藏

研究結(jié)果表明，3個月的低溫保藏，絕大部分菌株的萌發(fā)期延長，菌絲生長速率降低，表明菌株的活力下降。但也有特殊情況，品種L-02的萌發(fā)期雖然延長，但生長速率反而增加，這種情況雖不多見，但確實存在，有待于進(jìn)一步研究。黃年來[5]指出，“分離到單核菌絲后，應(yīng)立即進(jìn)行雜交”，“香菇單核菌株隨保藏時間的延長也影響雜交成功率”。劉新銳等[11]發(fā)現(xiàn)，低溫保藏會降低香菇漆酶、羧甲基纖維素酶木糖醇酶和淀粉酶等酶的活力。衣川堅二郎等報道，從香菇得到的單核菌株雜交后都能正常的雙核化，將這些單核菌株保存每年轉(zhuǎn)接1次到2次，經(jīng)幾年后，用其中的一些雜交發(fā)現(xiàn)22個親和組合中有3個為正常的雙核化，有7個為有限的雙核化，有12個為單側(cè)雙核化，大部分單核菌株隨保藏時間的延長失去了雜交能力。

香菇為四極性異宗結(jié)合的擔(dān)子菌，擔(dān)子產(chǎn)生4種交配型的孢子，在減數(shù)分裂產(chǎn)生孢子的過程中，來自2個核的16條染色體的基因發(fā)生重組，導(dǎo)致其攜帶的遺傳物質(zhì)差異顯著。李莉云等[12]發(fā)現(xiàn)來自同一菌株的香菇單核菌株不僅有菌絲形態(tài)及交配型的差異性，而且存在酯酶同工酶差異。譚琦等[13]利用RAPD技術(shù)對香菇孢子單核體的遺傳差異變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，同種交配型的孢子單核體遺傳相似性分別為66.3%和71.1%，遠(yuǎn)低于原生質(zhì)體單核體的。由此可見，香菇在減數(shù)分裂過程中染色體交換頻率較高，利用雜交選育香菇優(yōu)良菌株的潛力很大[14]。深入研究單核菌株及其雜交雙核菌株的性狀，將對香菇的雜交選育工作具有重要意義。