曹永生 ，李紹戊 ，王荻 ，盧彤巖 ，牟振波

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032）

近年來，細(xì)菌性疾病嚴(yán)重影響了我國(guó)鮭鱒魚健康養(yǎng)殖[5]，采用抗生素和化學(xué)藥物配合治療多是憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)，不僅產(chǎn)生了多重耐藥性菌株[6]，也易引發(fā)食品安全問題。噬菌體可以“捕食”細(xì)菌，而與細(xì)菌耐藥性無關(guān)，為解決耐藥性問題帶來了新的希望。

噬菌體較耐酸堿，可拌料投喂口服免疫，減少了免疫操作的工作量，避免了人為操作對(duì)魚體的應(yīng)激損傷[7]；皮膚或鰓的細(xì)菌性疾病，則可采用藥浴[8]。噬菌體對(duì)治療魚類細(xì)菌性疾病很有吸引力。本文通過綜述鮭鱒魚致病菌相關(guān)噬菌體的生物學(xué)特性、作用機(jī)理、研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景、問題及應(yīng)對(duì)措施，以期為鮭鱒魚類細(xì)菌病噬菌體療法研究提供參考。

1 噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體能夠感染細(xì)菌，是地球上含量最豐富的微生物。據(jù)估算，其總量達(dá)1031個(gè)數(shù)量級(jí)[9]。與其他病毒一樣，噬菌體不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，依靠宿主的細(xì)胞成分和功能進(jìn)行自身復(fù)制，產(chǎn)生子代。目前已知超過95%的噬菌體由具有尾部的蛋白衣殼包裹的線性、雙鏈DNA組成，其余的噬菌體由無尾部衣殼包裹的雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA組成[10]。

根據(jù)形態(tài)和核酸類型，國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將噬菌體分為尾病毒目Caudovirales和套式病毒目Nidovirale。根據(jù)尾部結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度和是否可伸縮，尾病毒目進(jìn)一步分為尾部長(zhǎng)而可伸縮的肌病毒科Myoviridae、尾部長(zhǎng)而不可伸縮的管狀病毒科Siphoviridae和尾部短而不可伸縮的短尾病毒科Podoviridae。

噬菌體的生活周期可分為兩種，即裂解周期和溶原周期。烈性噬菌體通過受體識(shí)別，吸附于細(xì)菌表面，向細(xì)胞內(nèi)注入自身遺傳物質(zhì)，利用宿主胞內(nèi)的分子構(gòu)建自身及酶類等物質(zhì)，進(jìn)行基因組復(fù)制和病毒蛋白的合成與加工，組裝子代噬菌體，裂解細(xì)菌，釋放子代噬菌體，完成噬菌體的裂解周期。溫和噬菌體不急于裂解細(xì)菌，而是將其基因組在特定的位置插入到宿主染色體中，所插入的噬菌體基因組稱為前噬菌體，含有溶原體的細(xì)菌細(xì)胞稱為溶原體，前噬菌體隨著細(xì)菌基因組的復(fù)制而復(fù)制，穩(wěn)定存在于細(xì)菌基因組中。在細(xì)菌遭受刺激和不良環(huán)境影響時(shí)，溶原周期終止，進(jìn)入裂解周期。前噬菌體的插入，通常會(huì)改變細(xì)菌的特性。有證據(jù)表明，細(xì)菌毒力基因和耐藥性很可能與前噬菌體所攜帶的基因片段有關(guān)。因此，治療細(xì)菌感染所用噬菌體必須為能裂解細(xì)菌的烈性噬菌體，且不能含耐藥性、致病性和溶原化的基因片段[11]。

2 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)及其作用機(jī)理

與抗生素相比，噬菌體治療細(xì)菌病主要有以下優(yōu)勢(shì)：①能殺滅耐藥菌。噬菌體通過感染-繁殖-裂解循環(huán)周期殺滅細(xì)菌，與細(xì)菌是否耐藥無關(guān)；②特異性強(qiáng)，對(duì)除致病菌外的其他細(xì)菌無殺傷，對(duì)機(jī)體正常菌群基本無影響；③低毒、對(duì)環(huán)境影響小。噬菌體基本不引起強(qiáng)烈的機(jī)體反應(yīng)，殺滅宿主菌后可自行消失；④噬菌體分離快速、成本低廉，且分布廣泛，常與細(xì)菌相伴存在，用宿主菌為誘餌可在水、土壤和動(dòng)物體內(nèi)快速分離目標(biāo)噬菌體；⑤接種途徑多樣，可通過口服、氣霧、浸泡和注射等方式給藥。

圖1 噬菌體的分類（A）及生活周期（B）[10]Fig.1 The classification（A）and life cycle（B）of phages

純化的噬菌體可直接用于治療細(xì)菌性疾病。噬菌體在受體識(shí)別、DNA無法注入和無法合成自身所需物質(zhì)等因素的影響下往往出現(xiàn)宿主譜較窄的情況[12]。窄的宿主范圍可避免噬菌體對(duì)機(jī)體內(nèi)正常菌群的副作用，但也限制了其對(duì)細(xì)菌的有效殺傷范圍。所以，通過持續(xù)的篩選和鑒定，積累對(duì)細(xì)菌不同菌株具有裂解作用的噬菌體，將幾種特異性較強(qiáng)的噬菌體以雞尾酒法配合使用是確保噬菌體專一并有效的方法[13]。也可在掌握噬菌體的遺傳背景和基因組結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用分子生物學(xué)方法改造噬菌體，以拓寬其宿主譜[14]。采用直接療法必須保證噬菌體全程具有活性，這需要充分了解所用噬菌體的理化和裂解特性。例如，對(duì)氯仿、溫度和乙醚的耐受程度決定了噬菌體制備方案；最佳感染條件及其復(fù)制曲線決定了噬菌體的使用條件和方式[15]。

王星宇 男，1994年生于四川綿陽(yáng).現(xiàn)為空軍工程大學(xué)信息與導(dǎo)航學(xué)院碩士研究生.主要研究方向?yàn)樾l(wèi)星通信，多址接入控制技術(shù).

在解析了噬菌體的裂解機(jī)制后，可利用噬菌體中具有裂解活性的成分來殺滅細(xì)菌。裂解活性成分主要有穿孔素和裂解酶等。在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制到后期時(shí)，噬菌體可通過自身編碼蛋白（穿孔素）在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜打孔，改變胞壁質(zhì)，便于裂解酶與肽聚糖接觸，發(fā)揮裂解作用。穿孔素的一級(jí)結(jié)構(gòu)不保守，但氨基酸水平的差異不影響其發(fā)揮能。穿孔素主要由疏水跨膜區(qū)（hydrophobic transmembrane domain，TMD）和羧基端帶有高電荷的親水區(qū)組成。穿孔素分為三類：I類由95個(gè)以上的氨基酸組成，含有3個(gè)TMDs，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus噬菌體和大腸桿菌Escherichia coli噬菌體λ的穿孔素均屬于此類型；II類的長(zhǎng)度為65～95個(gè)氨基酸，包含2個(gè)TMDs，如產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens噬菌體的穿孔素；III類穿孔素只有1個(gè)TMD，如噬菌體ΦCP26F穿孔素[16]。

裂解酶是噬菌體感染后期產(chǎn)生的一種細(xì)胞壁水解酶。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組分，能保證細(xì)胞滲透壓正常，一旦遭到破壞，細(xì)菌因滲透壓的改變而裂解。噬菌體感染后期，穿孔素在細(xì)胞膜上打完孔，裂解酶穿過細(xì)胞膜接觸并水解肽聚糖，引起細(xì)菌破裂，釋放子代噬菌體[17]。裂解酶從外部直接接觸到細(xì)菌肽聚糖也可引起細(xì)菌崩解。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁由90%的肽聚糖和10%的磷壁酸組成，肽聚糖易與裂解酶接觸，而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁除肽聚糖外，還有脂類和蛋白，肽聚糖含量少且不易與裂解酶接觸。因此，裂解酶主要應(yīng)用于革蘭氏陽(yáng)性菌，但最近也有報(bào)道能裂解革蘭氏陰性菌的裂解酶[18]。革蘭氏陽(yáng)性菌噬菌體裂解酶通過胞壁結(jié)合區(qū)（cell wall binding domain，CBD）與細(xì)菌結(jié)合，之后通過酶活區(qū)（enzymaticallyactive domain，EAD）特異性地破壞肽聚糖化學(xué)鍵，水解肽聚糖。革蘭氏陰性菌的裂解酶則為僅含EAD的球形蛋白，以便穿過細(xì)菌外部的脂多糖和蛋白質(zhì)，到達(dá)肽聚糖處[19]。

噬菌體穿孔素和裂解酶只攻擊特定細(xì)菌，直接溶解細(xì)菌，不涉及到噬菌體復(fù)制過程，不易受宿主譜的限制和變異的影響。穿孔素和裂解酶本質(zhì)為蛋白質(zhì)，能借助現(xiàn)有的成熟體系大量生產(chǎn)、純化和評(píng)價(jià)，可避免人們對(duì)直接采用本質(zhì)為病毒的噬菌體治療的擔(dān)憂，具有良好的應(yīng)用前景。

3 噬菌體在鮭鱒魚致病菌治療中的應(yīng)用

近些年，針對(duì)鮭鱒魚細(xì)菌病病原的噬菌體分離、鑒定和應(yīng)用研究取得了一些進(jìn)展，現(xiàn)按病原分類敘述。

3.1 嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila

嗜水氣單胞菌為一種運(yùn)動(dòng)型革蘭氏陰性桿菌，可引起鰓、腦、心、腸道、腎臟和肝臟等局部病變的敗血癥，發(fā)病率和死亡率很高[20]，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類的主要病原菌之一。

噬菌體pAh1-C和pAh6-C從河流水中分離獲得，以嗜水氣單胞菌（JUNAH）為宿主菌。經(jīng)鑒定兩株噬菌體均為肌病毒科，基因組為55kb和58kb的雙鏈DNA。體外實(shí)驗(yàn)表明，pAh1-C和pAh6-C對(duì)魚源致病性嗜水氣單胞菌具有較高的裂解效力，潛伏期分別為30 min和20min，裂解量為60pfu/cell和10pfu/cell。給泥鰍Misgurnus anguillicaudatus一次接種上述兩種噬菌體中的任一種均可顯著提高嗜水氣單胞菌感染的存活率，證實(shí)pAh1-C和pAh6-C在治療魚類嗜水氣單胞菌病中具有良好的應(yīng)用前景[21]。從污水中分離獲得的嗜水氣單胞菌致病株噬菌體VTCCBPA6屬肌病毒科。根據(jù)衣殼蛋白基因gp23的進(jìn)化分析和SDS-PAGE鑒定，可將其歸為T4樣病毒屬。但根據(jù)gp23比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VTCCBPA6與感染腸桿菌的T4樣噬菌體更為接近，而不是感染氣單胞菌的T4樣噬菌體，說明該噬菌體是環(huán)境中出現(xiàn)感染嗜水氣單胞菌的新型噬菌體[22]。為評(píng)價(jià)噬菌體控制嗜水氣單胞菌引起的條紋鯰Pangasianodon hypophthalmus大量死亡的有效性，Le等從河水中分離獲得了兩株嗜水氣單胞菌噬菌體。它們的宿主譜較廣，甚至能夠裂解多重耐藥的嗜水氣單胞菌分離株。其中一株噬菌體的潛伏期為10min，裂解量為213pfu/cell。該噬菌體的保護(hù)率可達(dá)到100%，對(duì)照組的存活率僅18.3%，證實(shí)所分離的噬菌體有成為防治氣單胞菌病的新型制劑的潛力[23]。

3.2 殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida

殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種屬于氣單胞菌屬，革蘭氏陰性菌。感染后細(xì)菌可在心、腎臟、脾臟、肌肉和鰓等組織中聚集，引起組織病變。急性感染的魚死亡時(shí)可能不呈現(xiàn)明顯癥狀或病理變化，而在慢性感染階段，魚體可能昏睡、食欲不振和體表變黑，與大多數(shù)細(xì)菌性敗血癥相似。除了眼球突出外，腹鰭出血十分常見，特別是靠近胸基部、腹鰭和臀鰭區(qū)域，側(cè)面骨骼肌可演變?yōu)橐夯詨乃篮汀把园X瘡”[24]。

噬菌體phiAS5不僅裂解耐藥殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種，對(duì)氣單胞菌屬的其他細(xì)菌也有感染性。phiAS5基因組結(jié)構(gòu)為線性雙鏈DNA，全長(zhǎng)22.5kb，G+C含量為43%，包含323個(gè)開放閱讀框，69個(gè)啟動(dòng)子，33個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，24個(gè)tRNA編碼基因。phiAS5的開放閱讀框與T4樣氣單胞菌噬菌體同源性較高，與Aeh1親源性最近[25]。Kim等證實(shí)氣單胞菌噬菌體PAS-1對(duì)含有III型分泌系統(tǒng)的殺鮭氣單胞菌AS05株具有裂解活性。在此基礎(chǔ)上，用噬菌體PAS-1免疫虹鱒Oncorhynchus mykiss200h后，噬菌體被機(jī)體清除，此時(shí)可檢測(cè)到短暫的抗PAS-1中和抗體，以感染復(fù)數(shù)為104的劑量免疫虹鱒可提高存活率、延長(zhǎng)死亡時(shí)間，為PAS-1治療殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種感染提供了關(guān)鍵臨床數(shù)據(jù)[26]。GenBank中序列公開的12個(gè)烈性殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種噬菌體的基因序列比對(duì)結(jié)果表明，一些噬菌體的基因存在陽(yáng)性選擇；與宿主tRNA編碼基因相比，噬菌體基因組G+C含量存在偏差。依宿主譜識(shí)別差異，12株噬菌體可分為三類，第一類噬菌體（編號(hào)59.1和56）的宿主譜較窄，只識(shí)別不超過5株宿主菌，第二類噬菌體（編號(hào)32、3、65.2和ASP37）的宿主譜居中，識(shí)別10-30株宿主菌，第三類噬菌體（編號(hào)IV-A和51）宿主譜較廣，可裂解44株宿主菌，更適于臨床應(yīng)用[27]。

3.3 嗜冷黃桿菌Flavobacterium psychrophilum

嗜冷黃桿菌是黃桿菌屬的革蘭氏陰性菌，可引起虹鱒幼魚綜合癥（RTFS）或細(xì)菌性冷水病。該菌主要感染幼魚，病魚近尾鰭部壞死，伴有大量粘液，剖檢可見腹水、腸道炎癥、脾腫大和肝臟變色。感染魚和死亡魚均可向水中釋放細(xì)菌，通過外傷感染其它魚體[28]。

2008年Stenholm等自丹麥一個(gè)虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)分離出了22株嗜冷黃桿菌噬菌體。它們的基因組大小不盡相同，主要為 8.5～12kb、48kb 和 90kb，分別識(shí)別23株嗜冷黃桿菌中的5～23株細(xì)菌。18株噬菌體具有各自的宿主譜，每個(gè)噬菌體對(duì)不同細(xì)菌的裂解活性、釋放量、潛伏期明顯不同。噬菌體FpV-5、FpV-6、FpV-8、FpV-9 和 FpV-11 的宿主譜較廣，F(xiàn)pV-9的感染效率最高，特別是將FpV-4、FpV-9和FpV-21的雞尾酒式組合可感染27株本地分離的嗜冷黃桿菌中的24株，具有良好的應(yīng)用價(jià)值[29]。Madsen等用嗜冷黃桿菌及其噬菌體免疫虹鱒幼魚。細(xì)菌和噬菌體自分離至免疫10d后，發(fā)現(xiàn)同時(shí)接種細(xì)菌和噬菌體時(shí)噬菌體在魚體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)于單獨(dú)注射噬菌體。細(xì)菌和噬菌體主要存在于腎臟和脾臟，偶見于腦部。pH4.5～7.5時(shí)對(duì)噬菌體感染活性影響較小，但pH3時(shí)其活性消失，在無宿主菌時(shí)，噬菌體在未處理湖水中保存55d后感染活力降低104倍；保存于至-80℃甘油中仍具有感染活性，而保存于20℃時(shí)活性降低10倍。噬菌體與魚飼料混合時(shí)，對(duì)其感染活性影響較小。上述結(jié)果表明，噬菌體可用于治療嗜冷黃桿菌的感染，伴藥餌投喂可能是有效方法[30]。

序列比對(duì)結(jié)果表明，丹麥和智利的嗜冷黃桿菌噬菌體基因組大小39.302～89.01kb，GC含量27%～32%，丹麥?zhǔn)删w分離株不含有溶原化基因，而智利分離株為溫和噬菌體。根據(jù)基因組成和含量，上述噬菌體可分為3個(gè)不同的基因簇，表明嗜冷黃桿菌噬菌體的遺傳多樣性有限，結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列的不一致性達(dá)25%，可能與宿主菌的特異性決定有關(guān)[31]。

3.4 柱狀黃桿菌Flavobacterium columnare

柱狀黃桿菌為黃桿菌屬的革蘭氏陰性菌，可感染包括鮭鱒魚在內(nèi)的淡水魚，引起“柱形病”。感染魚早期呈非特異性，即昏睡、食欲不振，浮游于水面；特異性癥狀為皮膚變色、背鰭損傷、鰓小片尖端損傷，鰓壞死呈黃色。該病亦可由病魚水平傳播至健康魚[32]。FCL-2為感染柱狀黃桿菌的噬菌體，基因組大小為47142bp，GC含量為30.2%。比較結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CL-2與噬纖維菌屬噬菌體phiSM親緣關(guān)系最近。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，虹鱒經(jīng)FCL-2免疫后存活率（50%）顯著高于對(duì)照組（8.3%），僅向循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中加入1次噬菌體就可使虹鱒免于柱狀黃桿菌感染[8]。

3.5 魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri

魯氏耶爾森菌是革蘭氏陰性腸桿菌，是鮭科魚類腸炎紅嘴病的主要病原。該菌宿主范圍廣，大多數(shù)鮭都易感，急性感染時(shí)，魚種無明顯癥狀，死亡率卻很高；慢性感染時(shí)，魚體色改變、功能失調(diào)和昏睡等，伴有腹水、眼球突出、皮膚淤血和鰓絲尖端局部出血。粘膜下層充血導(dǎo)致口腔和下頜充血，但并不是所有病魚都出現(xiàn)這種癥狀。該病可水平傳播，許多無癥狀帶菌魚和鳥類都可攜帶、儲(chǔ)備魯氏耶爾森菌[33]。Ahmadpour等自疑似腸炎紅嘴病的病魚中分離魯氏耶爾森菌，也嘗試在虹鱒養(yǎng)殖水體或污水處理廠水體中分離針對(duì)該菌的噬菌體，經(jīng)雙層瓊脂法確定，所分離的噬菌體對(duì)魯氏耶爾森菌具有裂解活性。Maragheh污水處理廠噬菌體分離株滴度最高，而Urmia污水處理廠所分離的噬菌體滴度最低。提取基因組DNA并利用限制性內(nèi)切酶MspI進(jìn)行切割，發(fā)現(xiàn)所分離的噬菌體基因組DNA切割后條帶類似，基因組總長(zhǎng)均小于λ噬菌體基因組。這表明污水處理廠可能是獲得裂解魯氏耶爾森菌噬菌體的重要來源[34]。

3.6 熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens

熒光假單胞菌為假單胞菌屬革蘭氏陰性桿菌，在自然環(huán)境中分布廣泛，是感染野生或養(yǎng)殖鮭的條件致病菌。該菌可呈現(xiàn)慢性感染、無癥狀感染和急性出血性壞死，死亡率較高（＞15%）。病魚眼球突出、爛鰭、爛鰓、邊緣出血性皮膚潰瘍、兩側(cè)瘀點(diǎn)和體表變黑[35]。VW-6S和VW-6B為自中國(guó)納帕海高原濕地分離獲得的可感染熒光假單胞菌的噬菌體。電鏡觀察顯示，這兩株噬菌體的頭部和長(zhǎng)尾結(jié)構(gòu)呈二十面體（分別為66.7nm和61.1nm），屬管狀病毒科。兩株噬菌體的基因組大小為30～40kb，VW-6S的潛伏期和暴發(fā)期分別為60min和30 min，而VW-6B的潛伏期和暴發(fā)期均為30 min，二者感染的最適pH分別為8.0和10.0，溫度高于60℃時(shí)活性迅速降低[36]。Radhakrishnan等從污水和土壤中分離獲得了7株熒光假單胞菌噬菌體，分析了其宿主譜、形態(tài)、結(jié)構(gòu)蛋白和基因組，發(fā)現(xiàn)5#噬菌體在污水中含量豐富（5.9×107pfu/mL），宿主譜較廣，其結(jié)構(gòu)蛋白和DNA帶型與其他六株噬菌體明顯不同，根基土壤周圍的熒光假單胞菌分離株對(duì)污水中的噬菌體不敏感[37]。

3.7 金黃桿菌Chryseobacterium spp.

金黃桿菌是黃桿菌屬的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于環(huán)境中，近年來在患病虹鱒和大西洋鮭Salmo salar中均分離到該菌。病魚體側(cè)、肛門或尾柄處的皮膚和肌肉潰瘍性病變[38]。從密歇根湖水中分離獲得了 ΦFenriz、ΦHabibi、ΦMoody和 ΦVader四株噬菌體，均以大腸桿菌（ATCC8739）為宿主菌。與先前發(fā)現(xiàn)的噬菌體不同的是，這四株噬菌體可裂解包括金黃桿菌在內(nèi)的五種不同門類的細(xì)菌（其他四種為綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、大腸桿菌Escherichia coli、桿菌Arthrobacter sp.和微桿菌Microbacterium sp.）。它們的基因組大小均為65Kb左右，GC含量為54.9%左右，與綠膿桿菌噬菌體PB1聚為一類，推測(cè)這四株噬菌體的泛宿主譜特性可能與密歇根湖貧瘠自然環(huán)境所推動(dòng)的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制有關(guān)[39]。

4 噬菌體在鮭鱒魚細(xì)菌病防控應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)

雖然噬菌體可直接殺死細(xì)菌，與細(xì)菌耐藥性無關(guān)，也不影機(jī)體正常的菌群結(jié)構(gòu)，具有良好的應(yīng)用前景，但用噬菌體治療鮭鱒魚細(xì)菌病仍面臨著一些有待解決的問題。

4.1 噬菌體的“脫靶”問題

細(xì)菌和噬菌體作為對(duì)手，常伴而行，通過各自的進(jìn)化獲得生存。為了保證噬菌體有效殺滅細(xì)菌，必須充分考慮噬菌體失效的諸多可能，做好應(yīng)對(duì)準(zhǔn)備。細(xì)菌的變異非常迅速，可通過阻止噬菌體吸附、利用限制性修飾系統(tǒng)切割噬菌體核酸、利用CRISPR/Cas防御系統(tǒng)切割噬菌體DNA、通過利他性自殺引起頓挫型感染和通過環(huán)境QS信號(hào)控制受體基因表達(dá)、降低高密度時(shí)細(xì)胞對(duì)噬菌體感染的敏感性等多種方式產(chǎn)生噬菌體抗性[12]。噬菌體的宿主范圍有限，一種噬菌體僅能感染同一種細(xì)菌的若干菌株，甚至僅能感染一株細(xì)菌。為了防止噬菌體失效，持續(xù)分離噬菌體，盡可能擴(kuò)大保藏容量，使噬菌體的宿主范圍能覆蓋流行菌株，是較為有效的應(yīng)對(duì)方法。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，可以優(yōu)化分離策略以增加獲得廣譜噬菌體的可能。選擇宿主菌時(shí)，不要僅選擇一種細(xì)菌，而要采用混合宿主菌[40]；分離來源要選擇污水或貧瘠自然環(huán)境的水體[39]。用測(cè)序方法獲得噬菌體的基因組信息，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基因工程改造也可增強(qiáng)噬菌體對(duì)細(xì)菌的識(shí)別性[41]。

人工合成噬菌體的裂解酶和溶菌酶是目前治療細(xì)菌感染的研究熱點(diǎn)，然而，鮭鱒魚的致病菌幾乎都為革蘭氏陰性菌。它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，裂解酶或溶菌酶在體外難以與目標(biāo)分子接觸。因此，用裂解酶或溶菌酶治療鮭鱒魚細(xì)菌病有一些局限性。利用EDTA、檸檬酸和蘋果酸增加細(xì)菌外膜通透性，可使裂解酶殺滅革蘭氏陰性菌，但這種方法難以臨床應(yīng)用[42]。能殺滅革蘭氏陰性菌的裂解酶分子量較小，僅含EAD的球形蛋白，可以參照現(xiàn)有提高溶菌酶抗革蘭氏陰性菌活性的方法，用不同蛋白酶水解裂解酶或溶菌酶，獲得兼具裂解活性和穿透性的最小活性片段后，利用凝膠過濾色譜分離和液質(zhì)聯(lián)用鑒定活性最高的水解產(chǎn)物，利用其他分子生物學(xué)手段進(jìn)行強(qiáng)化，即可保持裂解酶或溶菌酶原有抗菌能力，又能使發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定[43]。

4.2 噬菌體的“安全性”問題

與抗生素不同，噬菌體為活的病毒，人們往往擔(dān)憂應(yīng)用噬菌體的安全性。（1）噬菌體與機(jī)體免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系。有尾噬菌體誘導(dǎo)較弱，甚至不誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)。更有實(shí)驗(yàn)表明，即使連續(xù)三次使用噬菌體ΦX174，大多數(shù)病人也未有不良反應(yīng)，僅有少部分有皮疹、頭痛和發(fā)燒等輕微癥狀[44]。還有更為詳盡的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。例如Hong等分別以高劑量（107PFU）和低劑量（105PFU）大腸桿菌O157:H7噬菌體免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫組小鼠的細(xì)胞因子水平與未免疫小鼠相當(dāng)，與劑量無關(guān)，說明噬菌體免疫并未引起急性免疫反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，口服抗生素和噬菌體免疫3周齡豬兩周后，兩個(gè)處理組間的微生物種群差異不顯著[45]。但有學(xué)者認(rèn)為，噬菌體作為異源微生物進(jìn)入機(jī)體后，同樣可被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，甚至產(chǎn)生中和抗體。機(jī)體的這種免疫防御會(huì)干擾噬菌體發(fā)揮效應(yīng)，而記憶免疫反應(yīng)則會(huì)影響噬菌體的后續(xù)使用[46]。（2）噬菌體感染細(xì)菌后，在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，后期裂解細(xì)胞使細(xì)菌內(nèi)容物（包括內(nèi)毒素）局部大量釋放，而隨著噬菌體大量產(chǎn)生子代，再次裂解細(xì)菌，這種不受控制周而復(fù)始的循環(huán)易引起炎癥或過敏性反應(yīng)，形成組織損傷。為了避免細(xì)菌內(nèi)毒素大量釋放，Paul等[47]利用基因工程方法使金黃色葡萄球菌噬菌體P954的裂解酶失能，制備了喪失裂解力的重組噬菌體。這種突變噬菌體與野生型識(shí)別的宿主范圍并無差別，可感染細(xì)菌，但并不會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞裂解，而用其免疫時(shí)，可使小鼠完全抵抗致死劑量的金黃色葡萄球菌攻擊。（3）噬菌體可通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得遺傳學(xué)物質(zhì)。噬菌體可向細(xì)菌基因組插入基因片段，改變細(xì)菌的特性（增強(qiáng)毒力或耐藥性）。如噬菌體自身含有耐藥基因CTXΦ，原噬菌體對(duì)霍亂弧菌的毒力增強(qiáng)；噬菌體也可因其基因組整合細(xì)菌毒力基因片段而產(chǎn)生毒素[11]?？梢岳肞CR方法剔除基因組中含有溶原基因、細(xì)菌毒力基因或耐藥基因的噬菌體，選擇應(yīng)用安全的烈性噬菌體。（4）目前還沒有一套標(biāo)準(zhǔn)的噬菌體臨床審批和評(píng)價(jià)體系，限制了噬菌體相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的成果轉(zhuǎn)化與應(yīng)用。伴隨噬菌體的應(yīng)用中的這些問題，噬菌體裂解酶本質(zhì)為一種能夠裂解細(xì)菌的蛋白質(zhì)，可利用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)類生物制品的生產(chǎn)和評(píng)價(jià)方法而逐漸走入人們的視野。最新研究結(jié)果表明，裂解酶LysGH15可殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，雖然它可使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，但這些抗體并未阻斷LysGH15的結(jié)合能力和裂解活性。即使抗體達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)，LysGH15免疫也可有效攻擊小鼠，抵御體內(nèi)抗致死劑量的細(xì)菌，且可減弱促炎癥因子的表達(dá)，又不引起明顯的副反應(yīng)和組織器官的病理變化[48]，這就為噬菌體的未來應(yīng)用提供了可行的參照方法。

5 小結(jié)與展望

隨著養(yǎng)殖強(qiáng)度的加大和環(huán)境的惡化，鮭鱒魚類細(xì)菌傳染性疾病時(shí)常出現(xiàn)，導(dǎo)致魚類的大量死亡和品質(zhì)下降。頻繁、不規(guī)范的使用抗生素導(dǎo)致了多重耐藥菌的出現(xiàn)，也易引起食品安全問題。噬菌體為可殺滅細(xì)菌且與其耐藥性無關(guān)的微生物，為鮭鱒細(xì)菌性疾病的生物防治提供了新的可能。應(yīng)堅(jiān)持對(duì)我國(guó)鮭鱒魚主要致病菌噬菌體進(jìn)行持續(xù)分離和保藏，深入研究掌握噬菌體的特性、解析噬菌體的裂解機(jī)制和鑒定有效的裂解成分、建立噬菌體療法的效果和安全評(píng)價(jià)體系，利用新思路和新方法優(yōu)化噬菌體的使用方式，助力噬菌體在我國(guó)鮭鱒細(xì)菌性疾病治療中的應(yīng)用。