文/汪德家

在等梯度洗脫過(guò)程中我們往往會(huì)忽略溶劑純度對(duì)色譜行為的影響 // 這種影響在HPLC中尚不明顯，但是在UPLC中情況有所變化。使用純度較差流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段可能影響尚不明顯，隨著實(shí)驗(yàn)的深入，雜質(zhì)積聚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將不可避免的出現(xiàn)偏差，選擇純度符合實(shí)驗(yàn)要求的洗脫溶劑，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確可靠。

高效液相色譜(HPLC)和超高效液相色（UPLC）是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備，其廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研究以及環(huán)境研究中。

一般而言，液相色譜有等強(qiáng)度和梯度洗脫兩種洗脫方式。等度洗脫是指在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定,適合于組分?jǐn)?shù)目較少,性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是指在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等,用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間,提高分離度,改善峰形,提高檢測(cè)靈敏度,但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性，為此需要采取一些措施，如流動(dòng)相按一定比例預(yù)混等，以達(dá)到消除基線波動(dòng)，提高重現(xiàn)性的目的，在此過(guò)程中我們往往會(huì)忽略溶劑純度帶來(lái)的影響，在HPLC中溶劑純度的影響尚不明顯，但是在UPLC中情況有所變化。UPLC因?yàn)槭褂酶☆w粒填料、更快流速進(jìn)行快速檢測(cè)，流動(dòng)相純度差的影響會(huì)迅速積聚，基線漂移程度加重，實(shí)驗(yàn)不能重現(xiàn)，甚至出現(xiàn)鬼峰，倒峰等，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成資源的浪費(fèi)，特別是雜質(zhì)分析，含量測(cè)定等實(shí)驗(yàn)，我們更需要關(guān)注流動(dòng)相的純度，以盡可能的使實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近真實(shí)值。

實(shí)驗(yàn)部分

儀器與材料

乙腈和甲醇(色譜純，上海星可試劑)；

乙腈和甲醇(色譜純，進(jìn)口試劑)；

Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)；；

Waters Acquity UPLC液相色譜系統(tǒng)；

Agilent@C18(5.0um4.6*250mm)；

CORTECS@C18 (2.7um4.6*50mm)。

HPLC色譜條件

Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)；

色譜柱：Agilent@C18(5.0um4.6*250mm)；

流動(dòng)相A為純水，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫梯度見(jiàn)表1 ；

柱流速2.0 ml/min；

柱溫25℃

檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm和254 nm。（甲醇的檢測(cè)條件與乙腈相同，但檢測(cè)波長(zhǎng)分別為235 nm和254 nm）

表1 HPLC的洗脫梯度。

UPLC色譜條件

Waters Acquity UPLC液相色譜系統(tǒng)；

色譜柱：CORTECS@C18(2.7um4.6*50mm)；

流動(dòng)相A為純水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表2；

柱流速1.0 ml/min；

柱溫：40℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)： 200 nm和254 nm。

（甲醇的檢測(cè)條件與乙腈相同）

表2 UPLC的洗脫梯度。

結(jié)果

HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由按照ACS標(biāo)準(zhǔn)程序洗脫法分析溶劑的洗脫特征為平滑的洗脫曲線，雜質(zhì)峰幾乎接近儀器信號(hào)的噪音水平，雜質(zhì)水平達(dá)到HPLC儀器的最低檢測(cè)能力，所有品牌甲醇和乙腈都達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)HPLC分析結(jié)果幾乎不存在影響。

UPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，在200 nm下甲醇梯度變化為平滑曲線，各品牌甲醇在此條件沒(méi)有明顯區(qū)別，但在254 nm下色譜圖中出現(xiàn)雜質(zhì)，比較不同廠家的甲醇，其中上海星可試劑生產(chǎn)的甲醇相對(duì)于進(jìn)口的甲醇對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾最小。

圖1甲醇UPLC梯度洗脫色譜圖。

由圖2可知，各廠家生產(chǎn)的乙腈在UPLC條件下均對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，其雜質(zhì)種類和水平相差不大，綜合考慮，可能上海星可試劑生產(chǎn)的乙腈，純度更高，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾較小。

圖2乙腈UPLC梯度洗脫色譜圖。

討論

色譜系統(tǒng)的維護(hù)和故障排除最簡(jiǎn)便的途徑就是不要完全被動(dòng)地去應(yīng)付各種問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)前，我們需要有一個(gè)全面的考量，對(duì)于實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題做好預(yù)防措施，如定期更換密封墊圈，更換新的保護(hù)柱等。此時(shí)作為洗脫溶劑的流動(dòng)相的純度更是不容忽視的，使用純度較差流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段可能影響尚不明顯，隨著實(shí)驗(yàn)的深入，雜質(zhì)積聚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將不可避免的出現(xiàn)偏差，按照正常的故障排除邏輯推理將要花費(fèi)大量的精力，在排除各種可能存在的儀器故障后才可能意識(shí)到流動(dòng)相的純度問(wèn)題。

目前，大量精密實(shí)驗(yàn)使用進(jìn)口試劑，以盡可能減少流動(dòng)相帶來(lái)的干擾，但我們也應(yīng)該看到，隨著我們國(guó)家的迅速發(fā)展，國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了很多優(yōu)秀的試劑生產(chǎn)企業(yè)，其生產(chǎn)工藝已經(jīng)接近國(guó)際先進(jìn)水平，產(chǎn)品品質(zhì)也已經(jīng)和進(jìn)口產(chǎn)品相差無(wú)幾，可以作為進(jìn)口產(chǎn)品的替代，甚至在UPLC中對(duì)雜質(zhì)的檢出限還略有優(yōu)勢(shì)。