丁和國， 徐玥△， 王近瑜， 劉順林

1湖州市第三人民醫(yī)院呼吸科(浙江湖州 313000)； 2湖州市中心醫(yī)院呼吸科(浙江湖州 313000)； 3蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(江蘇蘇州 215600)

盡管目前在非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療上有了很大進(jìn)步，但它仍然是全球因腫瘤引起死亡的主要病因之一，嚴(yán)重威脅著人類健康[1-2]。肺癌是一種由多個階段和步驟參與發(fā)生、發(fā)展的惡性腫瘤，在不同階段可能有不同基因起作用[3]。研究表明，長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，LncRNAs)主要參與基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控，通過將核糖核蛋白復(fù)合物引入特定的基因組位點(diǎn)來啟動組蛋白甲基化[4-5]，在腫瘤的生長、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中起著非常重要作用。Lnc00673作為癌基因，屬于一種長鏈非編碼RNAs，有可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著顯著作用[6-8]。本研究通過檢測Lnc00673蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)，觀察Lnc00673蛋白與臨床病理資料的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本 84例肺腺癌標(biāo)本(肺腺癌組)收集于2008年6月至2017年1月在湖州市第三人民醫(yī)院及湖州市中心醫(yī)院經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)切除、并通過病理檢查確診的組織標(biāo)本，所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本獲取前未采取包括化療的任何治療，其中男48例，女36例，年齡38～75歲，平均60.54歲；對所有患者手術(shù)之前都給予胸腹部CT、頭顱CT及骨掃描等檢查，按照肺癌TNM臨床分期：84例肺腺癌組織中Ⅰ、Ⅱ期52例，Ⅲ、Ⅳ期32例；并通過淋巴結(jié)穿刺或術(shù)前淋巴結(jié)切除活檢經(jīng)病理證實(shí)，44例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，30例對照組標(biāo)本為肺癌旁組織(所有組織取材位于病變組織距離>2 cm，并通過病理檢查確定為肺正常組織)。

1.2 試劑與方法 實(shí)驗(yàn)所用的蠟塊厚度為4 μm，經(jīng)過連續(xù)切片后進(jìn)行免疫組化染色，實(shí)驗(yàn)所用的SP免疫組化試劑盒及兔抗人Lnc00673單克隆抗體均從北京中山金橋生物有限公司購得。免疫組化(SP)方法檢測Lnc00673蛋白在肺癌組織中表達(dá)。采用抗體稀釋液代替作為陰性對照。檢測癌胚抗原(CFA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酯(NSE)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA211)水平。

1.3 結(jié)果判斷[9]判斷組織標(biāo)本的具體著色程度則通過光學(xué)顯微鏡觀察。Lnc00673蛋白陽性表達(dá)主要為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕褐色顆粒。通過高倍鏡下觀察4個不同的視野，均為隨機(jī)采取，計(jì)數(shù)表達(dá)陽性的細(xì)胞總數(shù)，采用百分比計(jì)分：表達(dá)陽性細(xì)胞的百分比≤10%計(jì)1分，表達(dá)陽性細(xì)胞百分比>10%而且≤50%計(jì)2分，表達(dá)陽性細(xì)胞百分比>50%且≤75%計(jì)3分，表達(dá)陽性細(xì)胞百分比>75%計(jì)4分；同時，根據(jù)細(xì)胞染色不同程度計(jì)分：表達(dá)為陰性計(jì)1分，表達(dá)為弱染色計(jì)2分，表達(dá)為中等染色計(jì)3分，表達(dá)為強(qiáng)染色計(jì)4分。陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分與細(xì)胞染色程度計(jì)分的乘積作為判斷結(jié)果：積分≤6分判斷為低表達(dá)，>6分則判斷為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，率的比較采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lnc00673在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 肺腺癌組Lnc00673高表達(dá)54例(64.3%)，低表達(dá)30例(35.7%)；癌旁組高表達(dá)0例(0%)，低表達(dá)30例(100%)。Lnc00673高表達(dá)率在肺腺癌組顯著高于癌旁組(2=18.55,P<0.000 1)。免疫組織染色結(jié)果圖1。

A：Lnc00673在肺腺癌組織中高表達(dá)；B：Lnc00673在肺腺癌組織中低表達(dá)；C：Lnc00673在肺癌旁組織中低表達(dá)圖1 Lnc00673蛋白在肺腺癌及肺癌旁組織中的表達(dá)情況(SP,×400)

2.2 Lnc00673在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在肺腺癌組織中檢測Lnc00673表達(dá)情況，其分期比較，Ⅲ、Ⅳ期較Ⅰ、Ⅱ期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移上比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在發(fā)病年齡、性別、原發(fā)部位、分化程度以及腫瘤大小方面等臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 Lnc00673的表達(dá)與部分常用腫瘤指標(biāo)檢測的關(guān)系 Lnc00673在肺腺癌表達(dá)與CEA升高與否比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與NSE、CYFRA211值高低差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

盡管當(dāng)前對肺癌的治療手段，包括手術(shù)、放射治療及抗腫瘤藥物使用等方法不斷發(fā)展，但肺癌仍然是全球與腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[10]。作為肺癌的主要病理類型的非小細(xì)胞肺癌，主要包括腺癌和鱗癌2個亞型[11]。肺癌有非常高的病死率，這與其腫瘤細(xì)胞的不斷增殖及具有侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[12]。不容置疑，明白腫瘤惡性增殖的分子機(jī)制對腫瘤的有效治療至關(guān)重要。

近年來，非編碼RNAs(non-coding RNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用受到廣泛關(guān)注，非編碼RNAs主要有微小RNAs(microRNAs)和長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，LncRNAs)。LncRNAs 的大小一般超過200個核苷酸，其存在于各種組織和細(xì)胞中，而且在機(jī)體的各個階段，如細(xì)胞分化、胚胎形成及腫瘤產(chǎn)生等方面都起著重要作用[13-14]。一些研究顯示，下調(diào)LncRNAs基因表達(dá)后，很多惡性腫瘤的生長增殖均受到明顯抑制。Lnc00673屬于LncRNAs中一種，其定位在17q25.1染色體上，長度約為2 275 nt[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)Lnc00673在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在非小細(xì)胞肺癌中Lnc00673可以通過下調(diào)NCALD基因(人類神經(jīng)鈣調(diào)素δ蛋白基因)的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[17]。

表1Lnc00673的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系例(%)

表2 Lnc00673的表達(dá)與部分常用腫瘤指標(biāo)檢測的關(guān)系

惡性腫瘤具有明顯的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，約90%的惡性腫瘤患者因?yàn)檗D(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡，但侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個相當(dāng)復(fù)雜的臨床病理問題，目前對其相關(guān)機(jī)制尚不完全明了。許多諸如鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC)[18-19]、癌胚抗原(CEA)[20-21]、神經(jīng)元特異烯醇化酯(NSE)[22-23]等分子標(biāo)志物在臨床上常常被用作惡性腫瘤包括肺癌的臨床診斷，但此類標(biāo)志物在對早期診斷肺癌和對預(yù)后進(jìn)行評估均缺乏足夠的特異性和敏感性。為了研究Lnc00673基因與肺腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，我們收集了84例肺腺癌與30例癌旁組織，通過免疫組化方法檢測Lnc00673蛋白的表達(dá)情況，并分析與其臨床病理因素之間的相關(guān)性。我們通過分析發(fā)現(xiàn)，Lnc00673蛋白在肺腺癌組織較肺癌旁組織表達(dá)明顯升高，而且Lnc00673蛋白的表達(dá)程度與肺腺癌的臨床分期、有無發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與性別、年齡、分化程度、原發(fā)部位及腫瘤大小無關(guān)。值得注意的是，已有相關(guān)學(xué)者從肺癌的細(xì)胞生物學(xué)角度研究發(fā)現(xiàn)干擾Lnc00673基因表達(dá)后可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，但對于其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[24-25]。由此我們認(rèn)為，Lnc00673基因可能在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展等機(jī)制上起重要作用。CEA、NSE、CYFRA211是目前在臨床上作為腫瘤檢查的常用指標(biāo)，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)CEA在Lnc00673蛋白高表達(dá)組升高較低表達(dá)組比較有明顯差異，所以我們認(rèn)為在臨床上可以通過聯(lián)合檢測Lnc00673蛋白和CEA來診斷肺腺癌，以提高對肺腺癌診斷的敏感性。

綜上所述，Lnc00673在肺腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，其有可能在肺腺癌的發(fā)生中起著一定的作用。