戎曉東， 陳炫光， 蔡維洵， 陳國章

中山大學(xué)腫瘤防治中心、華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室放療科(廣東廣州 510630)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma)簡稱肝癌,是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于我國惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，病死率位于我國腫瘤相關(guān)死亡率的第2位[1-2]。世界范圍內(nèi)每年約有70萬新發(fā)肝癌病例，其中我國占世界肝癌發(fā)病人數(shù)一半左右，近年來肝癌發(fā)病率更是有逐漸升高的趨勢。肝癌具有起病隱匿、惡性程度高、進(jìn)展迅速的特點，早期常無明顯癥狀，導(dǎo)致約80%肝癌患者被確診時已處于中晚期，從而喪失了手術(shù)機(jī)會[1-2]。由此可見，肝癌嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命。近年來，隨著放射治療技術(shù)的發(fā)展，立體定向放療已經(jīng)被證明在可手術(shù)或不可手術(shù)切除的肝癌患者中效果良好，可極大提高肝癌患者預(yù)后[3-6]。但在臨床實踐中有些肝癌患者存在著對射線并不敏感的現(xiàn)象，導(dǎo)致放療效果不佳[7-10]。然而，關(guān)于導(dǎo)致肝癌細(xì)胞放射抵抗的機(jī)制研究較少，因此，進(jìn)一步研究肝癌細(xì)胞放射抵抗的作用機(jī)制，靶定關(guān)鍵分子，具有重要的臨床意義。SNHG11，屬于長鏈非編碼RNA，定位于染色質(zhì)20q11.23，目前其功能尚不明確，2018年1月至2019年2月，我們通過分析SNHG11對肝癌細(xì)胞放療抵抗的生物學(xué)作用及對γH2AX表達(dá)水平的影響，為深入了解肝癌細(xì)胞放射治療抵抗提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 肝癌細(xì)胞株SK-Hep1和SMMC-7721均購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 c-caspase3一抗、總caspase3一抗、γH2AX一抗均購自美國Cell Signalling Technology(CST)公司，GAPDH一抗、β-actin一抗、HSP70一抗均購自北京銳抗，兔二抗、鼠二抗購自中山金橋；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SK-Hep1細(xì)胞使用含有10%南美胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，SMMC-7721細(xì)胞使用含有10%南美胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及感染 計算感染病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)量)÷病毒滴度，將SK-Hep1細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h后，1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量sh-con和sh-SNHG11慢病毒懸液，加至6孔板中培養(yǎng)8～10 h，再加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d。按照同樣的方法向SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Control和SNHG11的慢病毒，提取細(xì)胞總RNA，用qRT-PCR檢測細(xì)胞中SNHG11的表達(dá)水平，建立穩(wěn)定過表達(dá)和敲低SNHG11的細(xì)胞株模型。

1.5 RNA提取 將轉(zhuǎn)染了敲低或過表達(dá)SNHG11慢病毒48 h的SK-Hep1和SMMC-7721細(xì)胞株接種至6 cm皿中，即SNHG11、Control、sh-SNHG11、sh-con共4組，待細(xì)胞長至80%可進(jìn)行RNA的提取。培養(yǎng)好的細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌2遍，加入1 mL總RNA提取試劑Trizol(購自Invitrogen公司)，用移液槍反復(fù)吹吸以充分裂解細(xì)胞。待裂解液由黏稠變?yōu)榍逑『髮⒁后w吸入1.5 mL離心管中，冰上靜置5 min。向離心管中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩后離心15 min，液體分為3層，將含有RNA的上層水相到新的1.5 mL去酶離心管中，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒，充分混勻，離心10 min，去除上清，用75%乙醇(DEPC水配置)洗滌沉淀，去除上清后晾干，用DEPC水溶解RNA沉淀并測量濃度。

1.6 實時定量PCR RNA逆轉(zhuǎn)錄按PrimeScirpt逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說明書操作，定量PCR用SYBR Green PCR Mater Mix，定量PCR儀為Roche lightCycler 4800。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃孵育60 min，85℃孵育5 min終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95℃10 min預(yù)變性，95℃10 s變性，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。檢測完成后，計算機(jī)系統(tǒng)自動分析個樣本Ct值，采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達(dá)量。使用的引物序列如下：SNHG11-F：5′-GGTGCTGTGTACCTCCTCC-3′，SNHG11-R：5′-CAGATCAGGGTGCTGCAGG-3′。

1.7 Western blot 將構(gòu)建好的過表達(dá)或敲低SNHG11細(xì)胞株接種至6孔板中(分別為SNHG11、Control、sh-SNHG11、sh-con 4組)，待細(xì)胞貼壁以后進(jìn)行4 Gy照射，每組均收取未照射及照射后2、4、6 h的蛋白，進(jìn)行Western blot。首先用胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌3遍，加入適量RIPA裂解液裂解蛋白，振蕩、離心，去除沉淀，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，用沸水煮5～10 min，-80℃保存。蛋白電泳按照等質(zhì)量30 μg上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，一抗孵育、二抗孵育后，進(jìn)行ECL法暗室發(fā)光顯像，用Image J軟件測量條帶灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計。

1.8 細(xì)胞照射 肝癌細(xì)胞放射處理方法為：6 MV X射線進(jìn)行室溫垂直照射，劑量率為200 cGy/min，照射野為15 cm×15 cm，源皮距為100 cm。克隆形成實驗照射方法為，對慢病毒穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行放射，所使用劑量為0、2、4、6、8 Gy。Western blot檢測蛋白表達(dá)水平使用的劑量為4 Gy。

1.9 克隆形成實驗 將Control和過表達(dá)SNHG11的SMMC-7721細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染sh-con和sh-SNHG11的SK-Hep1細(xì)胞種植到培養(yǎng)板中，在孵箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行放射。種植細(xì)胞的數(shù)量和照射劑量都為梯度，分別是0 Gy種400個細(xì)胞，2 Gy種800個細(xì)胞，4 Gy種1 600個細(xì)胞，6 Gy種3 200個細(xì)胞，8 Gy種6 400個細(xì)胞。將照射后的細(xì)胞置于37℃，5%CO2的孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，向培基中按照1∶100的比例加入青鏈霉素混合液，每5 d換1次液。連續(xù)培養(yǎng)14 d后去除培基，以PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用甲醇固定1 h，1%結(jié)晶紫染色1 h，清水漂洗干凈。計數(shù)>50個細(xì)胞的集落數(shù)目，計算：貼壁率(PE)=對照組集落形成數(shù)÷種植細(xì)胞數(shù)×100%；存活率(SF)=(實驗組集落形成數(shù)÷細(xì)胞種植數(shù))÷貼壁率。用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，計算放射生物學(xué)參數(shù)。實驗重復(fù)3次。將穩(wěn)定表達(dá)Control和SNHG11的SMMC-7721細(xì)胞、sh-con和sh-SNHG11的SK-Hep1細(xì)胞株按照梯度細(xì)胞密度進(jìn)行鋪板培養(yǎng)，劑量梯度照射，然后計算克隆形成率，按照公式y(tǒng)=1-[1-exp(-kx)]N擬合細(xì)胞存活曲線并計算放射生物學(xué)參數(shù)[11-12]。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建敲低和過表達(dá)SNHG11細(xì)胞模型 我們在幾株肝癌細(xì)胞中檢測SNHG11的表達(dá)水平，最終確定SNHG11表達(dá)水平較高的SMMC-7721細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定敲低細(xì)胞株，表達(dá)水平低的SK-Hep1細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)細(xì)胞株。我們在SK-Hep1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-con和sh-SNHG11，在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Control和SNHG11慢病毒質(zhì)粒后，Control、SNHG11、sh-con與sh-SNHG11組SNHG11的mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.00、93.68±3.80、1.39±0.14和0.26±0.05。見圖1。

*與Control比較P<0.05;△與sh-con比較P<0.05圖1 qRT-PCR檢測SNHG11的mRNA表達(dá)量

2.2 放療敏感性 過表達(dá)SNHG11后細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)N、Do、Dq、SF2分別為對照組(Control)的1.14、2.15、2.20、1.21倍，而敲低SNHG11(sh-SNHG11組)后N、Do、Dq、SF2分別為對照組(sh-con)的0.78、0.16、0.41、0.55倍，過表達(dá)SNHG11導(dǎo)致細(xì)胞放療抵抗，而敲低SNHG11后細(xì)胞放療敏感性增加。見圖2和表1。

A:sh-con與sh-SNHG11;B:Control與SNHG11圖2 單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線

表1 單擊多靶模型參數(shù)值

2.3 DNA損傷相關(guān)蛋白檢測 在4 Gy放療情況下，過表達(dá)SNHG11后γH2AX表達(dá)水平較Control組低，而敲低SNHG11后表達(dá)水平隨時間增加。見圖3、表2。

2.4 放療情況下細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測 放療可以增加細(xì)胞中凋亡蛋白c-caspase3的表達(dá)，而過表達(dá)SNHG11能部分逆轉(zhuǎn)c-caspase3的表達(dá)上調(diào)，敲低SNHG11可以進(jìn)一步促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)。見圖4、表3。

3 討論

研究表明放療在肝癌中發(fā)揮越來越重要的作用，其中SBRT可以使小肝癌2年局部控制率達(dá)到85%以上，在局部晚期肝癌患者中2年局部控制率達(dá)到接近40%～60%[5-6]，但是仍然有部分肝癌患者因放射抵抗導(dǎo)致腫瘤控制不佳進(jìn)而預(yù)后較差。因此尋找肝癌放射抵抗的分子機(jī)制，對提高肝癌患者在放療局部控制率方面有著非常重要的意義。

在本研究中，我們使用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，從而計算放射生物學(xué)參數(shù)N、Do、Dq、SF2、k。

圖3 Western blot檢測DNA損傷修復(fù)蛋白在4 Gy照射下隨時間的表達(dá)變化表2 不同處理組γH2AX的表達(dá)水平

組別0 h2 h4 h6 hControl63.59±1.2469.22±0.4174.98±1.4263.58±1.68SNHG1146.75±2.02?31.50±2.15?45.13±0.03?57.75±1.22?sh-con49.75±0.2396.60±1.3096.25±1.1793.82±2.52sh-SNHG1190.83±2.78△83.91±1.61△81.03±0.55△77.57±0.42△

*與Control比較P<0.05；△與sh-con比較P<0.05

圖4 Western blot檢測c-caspase3、總caspase3的表達(dá)

表3 不同處理組c-caspase、caspase的表達(dá)水平

*與Control+IR比較P<0.05；△與sh-con+IR比較P<0.05

這些衡量放射敏感性的參數(shù)能夠較真實全面地反映細(xì)胞放射生物學(xué)特性，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞放射敏感性的分析。這些參數(shù)分別從不同角度反映細(xì)胞放射敏感性，N值反映細(xì)胞對放射引起損傷的修復(fù)能力(k=1/N)，Dq是細(xì)胞受損所需要的閾量，Do為曲線指數(shù)區(qū)下降63%所需要的劑量，SF2是2 Gy時的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，這些指標(biāo)數(shù)值越大，代表放射抵抗性增強(qiáng)[11-13]。通過計算放射生物學(xué)參數(shù)，我們認(rèn)為SNHG11可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞放療抵抗。

腫瘤細(xì)胞放射抵抗的產(chǎn)生是多基因、多因子、多步驟及多重機(jī)制共同作用的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞受到射線照射后，造成DNA雙鏈斷裂，激活DNA損傷修復(fù)信號通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，因此腫瘤中DNA損傷修復(fù)通路的過度激活可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在射線照射下的存活，也就是說，DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞放射抵抗的重要原因[14-15]。我們發(fā)現(xiàn)SNHG11高表達(dá)的肝癌細(xì)胞對射線抵抗，提示lncRNA在腫瘤細(xì)胞放射抵抗中發(fā)揮重要的作用，可能是由于SNHG11的高表達(dá)使得DNA損傷修復(fù)通路激活增強(qiáng)。H2AX為染色體組蛋白H2A家族的成員之一，在各種理化因素的刺激下，細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，H2AX被磷酸化成為γH2AX。γH2AX作為一種生物標(biāo)志物，能夠清楚反映DNA損傷修復(fù)和修復(fù)的情況[16-18]。γH2AX是DNA損傷修復(fù)通路中的重要分子，是DNA損傷重要的標(biāo)志，其表達(dá)升高提示DNA損傷加重，出現(xiàn)時間快提示DNA損傷出現(xiàn)早，消退時間快提示DNA損傷修復(fù)加快。本研究我們發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)SNHG11，射線誘導(dǎo)的γH2AX表達(dá)降低，提示SNHG11降低了射線誘導(dǎo)的DNA損傷，并加快了DNA損傷修復(fù)過程，提示SNHG11可能是通過增強(qiáng)射線引起的DNA損傷修復(fù)增加，進(jìn)而增加肝癌細(xì)胞的放射抵抗。

放療能夠?qū)е翫NA雙鏈斷裂，啟動細(xì)胞對DNA的修復(fù)機(jī)制，而無法被修復(fù)的損傷將引起細(xì)胞凋亡[19-21]。射線可以通過增加腫瘤細(xì)胞的凋亡達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞增殖的目的，因此我們猜想SNHG11導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放射抵抗可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的級聯(lián)活化是凋亡的一個重要標(biāo)志，這些蛋白酶中主要是caspase。在凋亡發(fā)生時，caspase能夠被剪切成活化狀態(tài)，如c-caspase3[22-23]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SNHG11過表達(dá)的肝癌細(xì)胞射線誘導(dǎo)的c-caspase3表達(dá)減少，而SNHG11沉默表達(dá)的肝癌細(xì)胞射線誘導(dǎo)的c-caspase3增加，而總的caspase水平?jīng)]有明顯變化，提示SNHG11可以抑制射線誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡。

已有大量的研究表明lncRNA在肝癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、代謝等方面發(fā)揮重要作用[24-25]，例如lncRNA-UFC1可以通過激活β-catenin促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[26]，SNHG6可以通過發(fā)揮內(nèi)源性ceRNA的作用促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等[27]。而對于lncRNA影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性的研究較少，并且大多數(shù)是對宮頸癌、鼻咽癌、膠質(zhì)瘤等癌種，例如lncRNA-GAS5 能夠通過調(diào)控miR-106b/IER3信號軸來增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性[28]；lncRNA ANCR通過抑制PTEN的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的放療抵抗性[29]。然而，對于lncRNA在肝癌放射抵抗中的作用卻鮮有報道，而我們的研究對于證明lncRNA參與肝癌細(xì)胞對射線抵抗提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，但是SNHG11如何調(diào)控肝癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路，其中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。