翟立娟 史倩倩 李想

摘要：利用28個(gè)表型性狀和CDDP分子標(biāo)記對(duì)延安萬(wàn)花山牡丹進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，萬(wàn)花山牡丹的表型性狀存在較大差異。質(zhì)量性狀的香農(nóng)多樣性指數(shù)變化范圍為0.28～1.21，其中花色、葉端形態(tài)、葉片顏色、花型等較高;9個(gè)數(shù)量性狀在樣本中差異極顯著，變異系數(shù)變化范圍為12.10%～69.23%，其中花瓣數(shù)、雄蕊數(shù)的變異系數(shù)較大。CDDP分子標(biāo)記分析結(jié)果表明，萬(wàn)花山牡丹有效等位基因數(shù)為1.599 4，Neis基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)分別為0.333 5和0.486 1，表明延安萬(wàn)花山牡丹具有較高的遺傳多樣性。2種分析方法結(jié)果具有一致性，均可將延安萬(wàn)花山牡丹分為三大類(lèi)，根據(jù)與紫斑牡丹和矮牡丹親緣關(guān)系可劃分為3個(gè)類(lèi)型，即接近矮牡丹的類(lèi)型、接近紫斑牡丹的類(lèi)型和中間類(lèi)型。

關(guān)鍵詞：牡丹;遺傳多樣性;表型性狀;CDDP分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)： S685.110.24 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0095-06

延安萬(wàn)花山位于陜西省延安市城區(qū)西南方向，長(zhǎng)期栽培多種牡丹品種，這些牡丹構(gòu)成中原牡丹品種群延安牡丹亞群[1-2]。延安萬(wàn)花山有延安牡丹（Paeonia yananensis）、矮牡丹（P. jishanensis）及紫斑牡丹（P. rockii）的野生居群[3-5]。關(guān)于延安萬(wàn)花山牡丹類(lèi)群的起源及物種地位有多種看法，鄭宏春等將萬(wàn)花山上的牡丹劃分為4個(gè)變型，即白花矮牡丹、紫斑矮牡丹、紅花矮牡丹和紫斑紅花矮牡丹[6]。洪濤等將其中小葉數(shù)11枚、花粉色、花瓣有紫黑色瓣塊的牡丹提升到種的級(jí)別，即延安牡丹[3]。洪德元等認(rèn)為，延安牡丹是矮牡丹和紫斑牡丹的雜交后代[7]，后人利用RAPD分子標(biāo)記[8]、孢粉學(xué)[9]、形態(tài)學(xué)標(biāo)記[4]、cpDNA序列和SSR分子標(biāo)記[10]得到類(lèi)似的結(jié)論。此地牡丹長(zhǎng)期處于半野生半栽培狀態(tài)，在花型、花色等性狀方面存在較大變異[11]，是挖掘觀賞植物重要性狀的關(guān)鍵基因和牡丹新品種培育的良好試材[12]。李嘉玨的《中國(guó)牡丹》記載，該地至少有16個(gè)品種。然而，筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地牡丹品種數(shù)量正急劇減少，某些品種僅剩幾株，甚至不見(jiàn)蹤跡，如不采取保護(hù)措施，這將是牡丹育種栽培資源的一大損失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)萬(wàn)花山上保存著一些仍未命名或品種名遺失的牡丹樣本。目前缺乏關(guān)于延安萬(wàn)花山牡丹品種及其遺傳多樣性的研究，這不利于該地牡丹資源的保存和合理開(kāi)發(fā)利用。

表型多樣性是了解遺傳變異的重要線(xiàn)索[13]，具有操作簡(jiǎn)單、直觀、便于觀察等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。在牡丹野生種[16-17]和栽培品種[18]的遺傳多樣性研究中，得到了較可靠的結(jié)果。保守DNA序列多態(tài)性（conserved DNA-derived polymorphism，CDDP）分子標(biāo)記是一種基于DNA保守序列的新型分子標(biāo)記方法，具有穩(wěn)定性、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，能產(chǎn)生豐富的遺傳信息[19]，已在水稻[20]、菊花[21]、栽培牡丹[22]等植物遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用。因此，這2種方法的結(jié)合，可以從表型和基因型2個(gè)維度去準(zhǔn)確、細(xì)致地了解其遺傳多樣性。

本試驗(yàn)以分布于延安萬(wàn)花山的24個(gè)牡丹樣本（包括10個(gè)形態(tài)能夠穩(wěn)定遺傳但尚未命名或品種名遺失的樣本、3個(gè)當(dāng)?shù)刈匀灰吧鸂顟B(tài)下的牡丹樣本和11個(gè)已被記載的牡丹品種）為研究對(duì)象，以延安市富縣分布的紫斑牡丹和山西省稷山縣的矮牡丹為對(duì)照，采用28個(gè)表型性狀分析和CDDP分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法研究延安萬(wàn)花山牡丹的遺傳多樣性，以期為該地牡丹種質(zhì)資源的保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014—2016年連續(xù)3年于牡丹花期對(duì)延安萬(wàn)花山牡丹進(jìn)行資源調(diào)查，對(duì)性狀能夠穩(wěn)定遺傳且開(kāi)花穩(wěn)定的24個(gè)類(lèi)型進(jìn)行表型性狀記錄，取每個(gè)類(lèi)型的3～5個(gè)植株嫩葉用于DNA提取;同時(shí)以延安市富縣張家林場(chǎng)的紫斑牡丹（108.76° E、36.36° N，海拔1 461 m）和山西省稷山縣的矮牡丹（35.72° N、110.95° E）為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)樣品的相關(guān)信息見(jiàn)表1和圖1，其中1～10號(hào)樣本尚未命名或品種名遺失，11～13號(hào)為萬(wàn)花山當(dāng)?shù)刈匀灰吧鸂顟B(tài)下的牡丹樣本，14～24號(hào)為已被記載的牡丹樣本[1，11]，25～26號(hào)為富縣紫斑牡丹，27號(hào)稷山縣的矮牡丹。

1.2 試驗(yàn)方法

參照成仿云等的方法[2，15，18]選擇具有代表性、遺傳相對(duì)穩(wěn)定的28個(gè)表型性狀，其中19個(gè)質(zhì)量性狀及賦值標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2，9個(gè)數(shù)量性狀見(jiàn)表3。利用改良的CTAB法[23]提取27份材料的DNA，然后參照李瑩瑩方法[19]利用14條CDDP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察和保存電泳圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

表型性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行質(zhì)量性狀的分布頻率分析、數(shù)量性狀單因素方差分析、采用Euclidean距離、Ward聚類(lèi)方法進(jìn)行Q型聚類(lèi)[18]。各性狀的遺傳多樣性采用香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于CDDP帶型，首先按照電泳圖譜中同一位置上DNA條帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，形成0/1矩陣，然后應(yīng)用POPGEN 32計(jì)算供試材料的有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)，最后運(yùn)用NTSYS軟件進(jìn)行UPGMA法構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖，其余計(jì)算由Excel 2007完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

24個(gè)延安萬(wàn)花山牡丹樣本質(zhì)量性狀分布及多樣性情況見(jiàn)表2，香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）的變化范圍為0.28～1.21，平均值為0.70。其中，多樣性指數(shù)最高的質(zhì)量性狀是花色（1.21），主要以白色（25%）、粉色（37.5%）、紫紅色（33.33%）及復(fù)色（4.17%）為主;共有6個(gè)質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)大于1， 包括葉端形態(tài)（1.08）、葉片顏色（1.01）、株型（1.03）、花型（1.07）及雄蕊瓣化情況（1.01）;葉面暈（0.29）、雌蕊瓣化（0.38）及房衣顏色（0.39）的香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）相對(duì)較低;柱頭顏色的遺傳多樣性指數(shù)最低（0.28）。

F值說(shuō)明了分析結(jié)果可靠程度和不同性狀在不同樣品間的差異程度。如表3所示，在群體水平上，延安萬(wàn)花山牡丹的9個(gè)數(shù)量性狀的差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），表明9個(gè)性狀在群體間層次上存在廣泛的變異。花瓣數(shù)在群體間F值最大（94.50）;雄蕊數(shù)和花徑的群體間F值較大，分別為81.90和45.98;外花瓣數(shù)的群體間F值最?。?.53）。多重比較結(jié)果（表3）顯示，盡管各數(shù)量性狀在居群間差異明顯，但是大多表現(xiàn)為連續(xù)變異。

數(shù)量性狀變異系數(shù)（CV）表示性狀的離散程度，反映表型的變異特征。延安萬(wàn)花山牡丹種質(zhì)資源的數(shù)量性狀（表3）變異系數(shù)變化范圍為12.10%～69.23%。其中花瓣數(shù)的變異系數(shù)最大，為69.23%，雄蕊數(shù)的變異系數(shù)較大，大于60%;小葉數(shù)量的變異系數(shù)（27.17%）、復(fù)葉長(zhǎng)的變異系數(shù)（16.70%）、花徑的變異系數(shù)（13.31%）和著花量的變異系數(shù)（22.74%）均較小;葉柄長(zhǎng)的變異系數(shù)最小，為12.10%。

根據(jù)28個(gè)表型性狀對(duì)所有材料進(jìn)行Ward聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，在遺傳距離為15.5時(shí)，供試材料被分為3個(gè)大類(lèi)，第Ⅰ大類(lèi)包含2份紫斑牡丹，它們小葉數(shù)量在30枚以上，花絲為白色，心皮為黃白色;第Ⅱ大類(lèi)包含22份樣本，包括了延安萬(wàn)花山大部分牡丹樣本和矮牡丹，當(dāng)?shù)氐陌档ぃ?1、12號(hào)樣本）與稷山縣矮牡丹的親緣關(guān)系較近;第Ⅲ大類(lèi)包含3份樣品，它們均為粉色，花型為皇冠型。在遺傳距離為9.5時(shí)，第Ⅱ大類(lèi)的樣本又可以分為4類(lèi)，第ⅰ類(lèi)包含萬(wàn)花山7號(hào)和萬(wàn)花春（19號(hào)）2份樣本，它們的雄蕊均有少量瓣化;第ⅱ類(lèi)包含6份萬(wàn)花山牡丹樣本和1個(gè)矮牡丹，其均為單瓣型，花瓣基部沒(méi)有色斑;第ⅲ類(lèi)包含7個(gè)樣本，其花瓣基部均有色斑，萬(wàn)花山5號(hào)、瑞香紫（15號(hào)）、萬(wàn)花山4號(hào)聚在一起，它們均為紫色花且花型為單瓣型;第ⅳ類(lèi)包含6個(gè)樣本，除粉盤(pán)黃珠（18號(hào)）花型為單瓣型外，其余樣本花型為重瓣型?？傮w上講，大部分延安萬(wàn)花山牡丹樣本在形態(tài)上更接近于矮牡丹。

2.2 CDDP的遺傳多樣性分析

利用14條CDDP引物對(duì)27份牡丹材料進(jìn)行擴(kuò)增，每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和比例及其特異性條帶和比例均有較大的差異（表4），表明CDDP分子標(biāo)記的多態(tài)性較高。利用POPGEN 32分析延安萬(wàn)花山牡丹遺傳多樣性，得到有效等位基因數(shù)為1.599 4，Neis基因多樣性指數(shù)為 0.333 5，Shannon-Wiener信息指數(shù)為0.486 1，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為109，多態(tài)性位點(diǎn)率為85.2%。結(jié)果表明延安萬(wàn)花山的牡丹多態(tài)性較高。

根據(jù)Neis遺傳一致度，利用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖3）。在遺傳距離0.718處，可將樣本分為3個(gè)類(lèi)群。其中，第Ⅰ類(lèi)群包括14個(gè)萬(wàn)花山牡丹和矮牡丹，其中的矮牡丹與萬(wàn)花山11號(hào)的親緣關(guān)系最近。第Ⅱ類(lèi)群包括9個(gè)樣本，2個(gè)野生紫斑牡丹屬于這一類(lèi)群，此類(lèi)群中樣本花瓣基多有色斑;第Ⅲ類(lèi)群包括4個(gè)樣本，3號(hào)和10號(hào)親緣關(guān)系最近，之后與12號(hào)和5號(hào)樣本聚在一起。

2.3 表型性狀和CDDP分子標(biāo)記的相關(guān)分析

在本研究中，2種方法的分析結(jié)果雖有差異，但也有一定的相關(guān)性。2種方法的香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）分別為0.70和 0.486 1，說(shuō)明延安萬(wàn)花山牡丹具有較高的遺傳多樣性。2種方法均可把27份樣本分為三大類(lèi)，花瓣基部沒(méi)有色斑的多與矮牡丹聚在一起，花瓣基部有色斑的多于紫斑牡丹聚在一起;同一色系或相近花型的延安萬(wàn)花山牡丹樣本遺傳距離較近。在2種方法的聚類(lèi)樹(shù)狀圖中，萬(wàn)花山9號(hào)和延州紅、獅子頭和延州粉均聚在一起，說(shuō)明它們彼此之間親緣關(guān)系比較近。

3 討論與結(jié)論

研究牡丹遺傳多樣性的方法有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生理生化標(biāo)記和分子標(biāo)記[24]，其中形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記使用最廣泛[25-27]。本研究中，延安萬(wàn)花山牡丹種質(zhì)資源的28個(gè)表型性狀存在明顯差異。CDDP分子標(biāo)記獲得的Neis基因多樣性指數(shù)，香農(nóng)多樣性指數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)的比例均較高。2種方法均說(shuō)明延安萬(wàn)花山牡丹具有較高的遺傳多樣性。但2種方法的聚類(lèi)結(jié)果也存在一定的差異，一方面是因?yàn)楸硇托誀钍菢悠返幕蛐椭?、環(huán)境效應(yīng)、基因型與環(huán)境互作效應(yīng)的綜合結(jié)果，而分子標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性只是DNA水平的變異;另一方面可能與其雜交起源遺傳背景有關(guān)。因此2種方法結(jié)合，才能更加準(zhǔn)確地分析種群的遺傳變異狀況。

延安牡丹是臨近區(qū)域分布的紫斑牡丹和當(dāng)?shù)匕档さ碾s交后代[10，12]。根據(jù)形態(tài)學(xué)分析，矮牡丹植株較矮，小葉多為9枚，近圓形或卵形，因頂生小葉分裂程度不同而表現(xiàn)9、11、15枚的變化;紫斑牡丹植株較高大，小葉數(shù)15枚及以上，多呈卵狀披針形，花色為白色、粉色和紫紅色[3-5];延安牡丹同時(shí)具有2個(gè)親本的性狀，小葉數(shù)11（13）枚，小型圓葉，花瓣基部具有紫黑色斑紋，主模式為瑞香紫中的1株[3，11]。本研究發(fā)現(xiàn)萬(wàn)花山還存在許多類(lèi)似于延安牡丹的半野生半栽培的牡丹樣本，小葉數(shù)15枚以上并呈卵狀（萬(wàn)花山11號(hào)）、花瓣高度瓣化（萬(wàn)花山3號(hào)）、花瓣基部有紅斑并且葉面有紅暈（萬(wàn)花山7號(hào)）的類(lèi)型或品種，明顯不同于矮牡丹和紫斑牡丹的性狀，說(shuō)明延安萬(wàn)花山牡丹存在豐富的變異，可以推斷為紫斑牡丹與矮牡丹的雜交后代只是在形態(tài)上出現(xiàn)了連續(xù)變異[28]。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，可以把萬(wàn)花山的牡丹分為接近矮牡丹的類(lèi)型，接近紫斑牡丹的類(lèi)型及中間類(lèi)型。接近矮牡丹的類(lèi)型大致包括2、7、8、11、12、17、19、20號(hào)材料，它們多為單瓣型，花瓣基部沒(méi)有色斑;接近紫斑牡丹的類(lèi)型包括4、13、14、15、18、21、22

號(hào)材料，它們花瓣基部多有色斑;中間類(lèi)型包括1、3、5、6、9、10、16、23、24號(hào)材料，這些材料多為重瓣花型。對(duì)于延安萬(wàn)花山牡丹的雜交機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明延安萬(wàn)花山牡丹存在豐富的變異，具有較高的觀賞和科研價(jià)值。重瓣類(lèi)型、具有色斑的類(lèi)型、雄蕊少量瓣化的類(lèi)型均可作為挖掘觀賞植物重要性狀的關(guān)鍵基因的重要種質(zhì)資源。然而，目前延安萬(wàn)花山牡丹種質(zhì)資源流失嚴(yán)重，應(yīng)該對(duì)萬(wàn)花山地區(qū)的牡丹進(jìn)行全面的資源清查和品種登記，加大科研力度，積極利用最新的育種和雜交技術(shù)，培育以延安萬(wàn)花山地區(qū)的牡丹為基礎(chǔ)的新品種。

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