劉 茹，陸曉和

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最嚴(yán)重和最為常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一。世界衛(wèi)生組織公布，DR是全世界導(dǎo)致視力缺損和失明的第二大原因，已成為眼底病基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，探究DR的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防策略具有重要的臨床意義。

miRNAs可參與腫瘤形成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡、糖尿病和心血管疾病等多種病理生理過(guò)程。miRNAs也存在于人的循環(huán)血液系統(tǒng)中，能夠從外周血檢測(cè)，而且穩(wěn)定性與重復(fù)性相對(duì)較好[1]。與mRNA不同的是，miRNAs在體液中相對(duì)穩(wěn)定，甚至能抵御RNA酶的消化作用[2-3]。這一特性使外周血miRNAs檢測(cè)有望成為惡性腫瘤及其它疾病新的非創(chuàng)傷性的標(biāo)記物[4-5]。在對(duì)DR的研究中，視網(wǎng)膜組織標(biāo)本很難獲得，為病理檢查和病理分析帶來(lái)很大困難，因此如果外周血miRNAs檢測(cè)能夠作為標(biāo)記物應(yīng)用于臨床，這對(duì)于DR患者將具有更為顯著的臨床意義[6-7]。臨床上，miRNAs在玻璃體液和房水中也可以檢測(cè)到特異性的表達(dá)[8-9]，Hirota等[8]研究表明，與新生血管化和纖維化有關(guān)的幾種miRNAs在DR患者玻璃體液中的表達(dá)明顯高于黃斑裂孔患者。這就使得miRNAs在玻璃體和房水中的表達(dá)差異可以提示某種疾病，為臨床提供一種診斷和預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志。Wu等[10]在鏈霉素注射10wk后成功建立糖尿病大鼠模型，并在糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)有11中microRNAs明顯升高，包括miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-135b、miR-592、 miR-190b、miR-363、miR-29c-5p，并且有6種MicroRNAs顯著降低，包括miR-10b、miR-10a、 miR-219-2-3p、miR-144、miR-338、miR-199a-3p。同時(shí)驚喜地發(fā)現(xiàn)，部分microRNAs在視網(wǎng)膜內(nèi)表達(dá)量的變化與DR的發(fā)展一致，這就表明microRNAs調(diào)節(jié)與DR之間有某種聯(lián)系。

microRNA-132(miR-132)是馬克斯普朗克學(xué)會(huì)Lagos-Quintana等[11]2002年在小鼠神經(jīng)組織中首次發(fā)現(xiàn)的，有研究表明[12]，miR-132與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)。最近Marler等[13]通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)由miR-132與p250GAP途徑，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)小鼠胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。臨床上，我們發(fā)現(xiàn)處于同一階段的糖尿病視網(wǎng)膜視神經(jīng)病變，預(yù)后可能截然不同，提示我們可能視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷程度不同，這就迫切需要一種分子生物學(xué)標(biāo)志能夠提示這種凋亡。已有研究表明[14]，miR-132在DR大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平升高，那么在DR患者循環(huán)體液中miR-132的表達(dá)情況，目前尚不清楚。本研究通過(guò)探討miR-132在不同分期DR患者血漿中的表達(dá)變化，有助于揭示miRNA-132與DR發(fā)展的關(guān)系，以期為DR尋求新的生物標(biāo)志物。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2015-07/10于我院內(nèi)分泌科確診的55例糖尿病患者，并由眼科醫(yī)師專人行眼底散瞳檢查和熒光素血管造影(fluorescein angiography，F(xiàn)FA)檢查，所有患者抽血前均未接受過(guò)眼部治療。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]：空腹血糖>7.0mmol/L或者OGTT 2h血糖>11.1mmol/L和糖化血紅蛋白>6.5%。按DR國(guó)際臨床分期標(biāo)準(zhǔn)將患者分為5組：背景期：無(wú)明顯視網(wǎng)膜病變組13例(A組)；非增殖期(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)33例，包括輕度NPDR組10例(B組)，中度NPDR組11例(C組)，重度NPDR組12例(D組)；增殖期(proliferative diabetic retinopathy，PDR)9例(E組)。另選取我院體檢健康者12例作為陰性對(duì)照組(F組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：眼部手術(shù)史，伴有嚴(yán)重高血壓病、嚴(yán)重高血脂癥、惡性腫瘤、肺部疾病及自身免疫性疾病患者，合并其他影響糖代謝的疾病(如甲狀腺功能亢進(jìn)等)，急性代謝紊亂綜合征，嚴(yán)重心腦血管疾病及外傷等。所有研究對(duì)象的年齡及是否規(guī)范控制血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本次研究經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均為自愿參加本次試驗(yàn)，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集由專人收集研究對(duì)象的一般資料，包括：性別、年齡、既往史、個(gè)人史、糖尿病持續(xù)時(shí)間、血糖、糖尿病并發(fā)癥、用藥史。

1.2.2試驗(yàn)方法抽取所有研究對(duì)象肘靜脈空腹全血5mL，按照Tiangen miRNA提取試劑盒進(jìn)行操作提取RNA，并檢測(cè)RNA純度，miRNA-132逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)用加尾方法，U6應(yīng)用普通逆轉(zhuǎn)錄方法逆轉(zhuǎn)錄通用引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG( T )24N( A，G，C)-3’。PCR下游引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；miRNA-132上游引物：5’-TAACAGTCTACAGCCATGGTCG-3’。U6上游引物： 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用SYBR Green I染料法進(jìn)行熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)，測(cè)量miR-132和U6的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1基本資料DR各組與健康對(duì)照組在男女構(gòu)成比例方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)；各組在年齡、是否規(guī)范治療方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組間糖尿病病程比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)，糖尿病病程越長(zhǎng)，DR越重(表1)。

2.2 PCR產(chǎn)物熔解曲線熔解曲線分析結(jié)果顯示熔解曲線形成單一峰，表明無(wú)非特異性產(chǎn)物和引物二聚體形成，引物的特異性良好(圖1)。

2.3 miR-132在各組患者血漿中的表達(dá)及與臨床資料的關(guān)系與健康對(duì)照組相比，除無(wú)明顯視網(wǎng)膜病變組外，其余各組DR患者血漿miR-132的表達(dá)水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；非增殖期各組間、非增殖期與增殖期組間比較，miR-132表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。本試驗(yàn)收集患者年齡、性別、糖尿病病程、是否規(guī)范治療作為影響患者血漿miR-132表達(dá)的因素。對(duì)以上因素與血漿中miR-132含量的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上因素均與血漿miR-132表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

3討論

目前，miRNAs表達(dá)量的檢測(cè)方法主要有4種：實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、miRNA芯片微陣列、分子探針技術(shù)、直接測(cè)序技術(shù)。其中qRT-PCR較其他方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確，更適合分析體液中得到的miRNAs。本研究中我們采用qRT-PCR方法檢測(cè)糖尿病患者血漿中miR-132的相對(duì)表達(dá)水平，且PCR熔解曲線為單一波峰，說(shuō)明miR-132引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化均較好，另外我們?cè)谠囼?yàn)中有效地避免了RNA酶的污染，同時(shí)采用U6作為內(nèi)參，提示本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)具有較高的可信度。

表1 糖尿病視網(wǎng)膜病變患者和健康對(duì)照組的臨床特征

分期例數(shù)性別(例,%)男女年齡(x±s,歲)病程(x±s,a)是否規(guī)范治療(例,%)是否背景期組135(39)8(61)55.2±3.123.9±2.74(31)9(69)輕度NPDR組104(40)6(60)56.1±5.85.8±3.77(70)3(30)中度NPDR組113(27)8(73)59.3±8.98.9±4.86(55)5(45)重度NPDR組124(33)8(67)63.1±11.812.6±5.54(33)8(67)PDR組92(22)7(78)63±16.116.2±4.63(33)6(67)健康對(duì)照組126(50)6(50)57.4±4.70-- P0.0490.3270.0100.526

圖1miR-132與U6熔解曲線A：miR-132；B：U6。

圖2miR-132在各組患者血漿中的表達(dá)A：miR-132在各組患者血漿中的表達(dá)；B：miR-132在NPDR與PDR兩組的表達(dá)。aP<0.05vs健康對(duì)照組；cP<0.05vs背景期DR。

miRNAs的自身結(jié)構(gòu)比較特殊，目前應(yīng)用較多的有兩種檢測(cè)方法：莖環(huán)法和加尾法，在原理上存在差異。兩種方法的反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)原則不同，而PCR 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)原則是相同的，也遵守常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)原則。這兩種方法的思路不同，導(dǎo)致引物設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方法上的差異。二者各有優(yōu)缺點(diǎn)，莖環(huán)法引物設(shè)計(jì)較困難，大量檢測(cè)成本高，但其特異性、靈敏度高于加尾法；而加尾法引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，操作容易。本試驗(yàn)中，最初設(shè)計(jì)用莖環(huán)法，但是在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，莖環(huán)法PCR結(jié)果中，水的PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)目的條帶，提示我們存在污染可能性，后改為加尾法進(jìn)行miRNAs的qRT-PCR試驗(yàn)。

miRNAs一般在細(xì)胞間隙內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，但在人類生物體液，如血清、血漿、尿液、唾液、淚液、房水和玻璃體中也能檢測(cè)到穩(wěn)定的miRNAs[16]，體液中的miRNAs不僅是在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下穩(wěn)定，而且在經(jīng)受冷凍、pH劇烈變化、長(zhǎng)時(shí)間放置室溫下都不會(huì)發(fā)生改變[3]，因此人們?cè)O(shè)想把它作為人類疾病病理學(xué)的分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行研究，并且在很多疾病中已經(jīng)報(bào)道了循環(huán)中的miRNAs表達(dá)譜，包括糖尿病疾病[17-19]。miR-132在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[14]，而在DR患者外周血循環(huán)中miR-132的表達(dá)情況，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-132在健康人和無(wú)明顯DR患者血漿內(nèi)表達(dá)量相對(duì)較高，在非增殖期和增殖期DR患者體內(nèi)miR-132表達(dá)量降低，這提示在DR發(fā)展過(guò)程中，miR-132有可能也起了保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用，從而阻止DR的發(fā)展，當(dāng)miR-132下降時(shí)，可能提示病變進(jìn)展，但隨著DR程度加重，miR-132表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Kovacs等[14]研究表明，miR-132在DR大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平升高，與我們的試驗(yàn)結(jié)果不一致，分析原因本次試驗(yàn)檢測(cè)的是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，而Kovacs等檢測(cè)的是miR-132在DR大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，這可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的原因；本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-132含量在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血漿內(nèi)含量相對(duì)較低，導(dǎo)致循環(huán)熒光域值(CT值)較大，PCR結(jié)果可能存在誤差，因此后續(xù)試驗(yàn)需要進(jìn)一步更為精確的檢測(cè)方法。有研究表明，在DR中MAPK1/3信號(hào)通路對(duì)視網(wǎng)膜血管損傷和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的釋放有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[20]。同時(shí)，MAPK3/1與DR病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡有關(guān)。而miR-132對(duì)小鼠胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[13]。那么miR-132與MAPK1/3信號(hào)通路在DR發(fā)展中的具體作用及對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，我們將通過(guò)對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。