武燕，馬秋艷，楊迎新，張丹丹，何宇鵬，楊玥

隨著整合眼科學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的研究開始關(guān)注全身疾病對眼睛的影響。中醫(yī)學(xué)將原發(fā)性開角型青光眼稱為“青風(fēng)內(nèi)障”。在臨床上，中醫(yī)理論認(rèn)為肝失疏泄導(dǎo)致的青光眼最為常見[1-3]。肝失疏泄的臨床特征表現(xiàn)為氣急、易怒、頭痛、眼脹及視物模糊。另外，國際上主流的研究表明，眼局部高眼壓[4-5]和大的眼壓波動(dòng)[6-7]均為青光眼進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。因此，全身肝失疏泄是否會導(dǎo)致眼局部高眼壓和大的眼壓波動(dòng)，從而導(dǎo)致青光眼的發(fā)生和發(fā)展，目前尚不清楚。本研究擬通過肝失疏泄大鼠模型，明確肝失疏泄大鼠模型的眼壓和眼壓波動(dòng)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康同系Sprague-Dawley雄性大鼠28只，體重200～220 g，SPF級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供。隨機(jī)分為2組。正常組14只，群養(yǎng)觀察；模型組（肝失疏泄組）14只，孤養(yǎng)，按程序施加造模刺激。光照節(jié)律 12/L:12/D （6:00～18:00），室溫（22±2）℃，保持動(dòng)物室安靜，相對濕度 30%～40%，常規(guī)飼料及正常飲水，每周測定體重。造模4周后測24 h眼壓，每周1次，共3次。測量時(shí)間為9:00～10:00,13:00～14:00,17:00～18:00,21:00～22:00,1:00～2:00。因動(dòng)物死亡及標(biāo)本制作等因素，最后有效數(shù)據(jù)第4周正常組24只眼，模型組12只眼，第5周正常組14只眼，模型組10只眼，第6周正常組12只眼，模型組6只眼。

1.2 動(dòng)物模型的建立

結(jié)合參考文獻(xiàn)［8］公認(rèn)的肝郁證方法復(fù)制動(dòng)物模型：夾尾 1 min，4℃冰水游泳 5 min，禁水 24 h，禁食24 h，晝夜顛倒24 h，45℃熱環(huán)境5 min。上述刺激1種/d，每種刺激各3次，隨機(jī)安排，使動(dòng)物無法預(yù)知次日的刺激。大鼠肝郁模型造膜成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：肝郁造模大鼠隨著造模時(shí)間的增加，逐漸出現(xiàn)肝郁證的行為學(xué)特征即大鼠飲水量增加，容易激惹，咬人，喜歡扎堆、貼邊，大便松散而特臭。

1.3 主要儀器與試劑

Tono-Pen AVIA手持式眼壓計(jì)（美國Reichert公司），桌面式小動(dòng)物麻醉機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），異氟烷（國藥準(zhǔn)字H19980141，河北九派制藥有限公司），鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天株式會社），左氧氟沙星滴眼液（日本參天株式會社）。

1.4 眼壓測量方法

SD大鼠用桌面式小動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉 （參數(shù)：氧濃度0.8%，異氟烷濃度5%），平放于桌面保溫毯，側(cè)臥位，采用Tono-Pen AVIA眼壓計(jì)，測量雙眼眼壓3次取其平均值作為最后測量結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，采用協(xié)方差分析，控制大鼠體重，比較2組在第4周、第5周和第6周三個(gè)階段，組間的平均眼壓和眼壓波動(dòng)（24 h眼壓的峰值減去谷值）變化。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組大鼠體重及基線眼壓值；當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組基線眼壓值和各個(gè)時(shí)間點(diǎn)體重比較

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)將SD大鼠分為正常組和模型組，在同一時(shí)間點(diǎn)測大鼠基線眼壓，正常組為（15.79±1.71） mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和模型組為（16.10±1.34） mm Hg，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.72,P=0.48)。 分別測得 2 組基線體重，正常組為（198±6）g，模型組為（195±7）g，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.63，P=0.72）。 第 4 周，正常組體重（362±28） g，模型組為（327±25） g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.58，P=0.00，見圖1）。 在第 5 周，正常組體重為（432±44） g，模型組為（327±19） g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（t=5.97，P=0.00）。 第6 周，正常組體重為（443±57）g，模型組為（382±15）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.49，P=0.00，見圖 1）。

圖1 2組的體重變化

2.2 造模4周后2組平均眼壓比較

造模4周后，模型組的24 h平均眼壓為（16.55±0.91）mm Hg，而正常組為（16.06±0.99） mm Hg，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.23，P=0.63）。造模第5周，模型組的 24 h 平均眼壓為（12.82±0.61）mm Hg，正常組的（12.66±1.08） mm Hg，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.56，P=0.78）；造模第6周，模型組平均眼壓為 （14.64±1.13）mmHg，高于正常組（13.23±1.08）mmHg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.53，P=0.04，見圖 2）。

圖2 2組的平均眼壓變化

2.3 造模4周后2組24 h眼壓波動(dòng)比較

眼壓波動(dòng)值為24 h眼壓的峰值減去谷值。造模4周后，模型組的24 h眼壓波動(dòng)在第4周、第5周和第 6 周分別為 （3.49±0.73）mmHg、（4.54±2.28）mmHg和 （5.44±1.59）mm Hg,分別高于正常組的 （3.47±1.06）mmHg、（4.31±1.22）mmHg 和 （4.03±2.04）mmHg，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見圖 3）。

圖3 2組的眼壓波動(dòng)

3 討論

元代朱丹溪《格致余論》[9]云：“司疏泄者肝也”。中醫(yī)眼科整體觀點(diǎn)認(rèn)為，五臟中以肝和眼的生理病理關(guān)系最為密切。肝開竅于目，足厥陰肝經(jīng)連目系。肝主氣，喜條達(dá)而惡抑郁，暴怒傷肝。肝藏血，目受血而能視。外界突然的或持久的精神刺激可造成肝氣郁滯、玄府閉塞、目系失養(yǎng)而視朦目盲，或?qū)е卤┡瓊巍庋軗p而急速暴盲；或抑郁寡歡、氣機(jī)疏泄不利、氣血失養(yǎng)日久、目系萎陷而逐漸青盲。以往研究[8]通過對大鼠施加慢性刺激，成功造出大鼠肝郁證模型，肝郁證大鼠發(fā)生了多種生理機(jī)能的變化，而中醫(yī)學(xué)五臟中，肝與眼的關(guān)系最為密切，所以，肝的疏泄功能失調(diào)，會在眼有所體現(xiàn)。研究表明[10]，平均眼壓升高1 mm Hg，青光眼進(jìn)展速度加快11%。本研究，我們對比了肝失疏泄大鼠模型與正常大鼠的眼壓變化，造模后第4周和第5周模型組的24 h平均眼壓均高于正常組。在造模后第6周，模型組平均眼壓為顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)肝失疏泄大鼠呈現(xiàn)出大的晝夜眼壓趨勢，造模后，模型組的24 h眼壓波動(dòng)在4周、5周和6周均高于正常組的各時(shí)間段。Asrani等[11]和Advanced Glaucoma InterventionStudy(AGIS)[12]證實(shí)無論是長期眼壓波動(dòng)還是24 h日間眼壓波動(dòng)均是青光眼進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。AGIS研究證實(shí)，長期眼壓波動(dòng)大于1mm Hg，青光眼進(jìn)展速度加快31%[12-13]。

肝主疏泄功能正常即可使眼的機(jī)能處于一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，表現(xiàn)為眼部血流及眼壓穩(wěn)定。否則，肝失疏泄，眼部血流和眼壓波動(dòng)[14-15]，而損害神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。越來越多研究證實(shí)，眼壓波動(dòng)[16-17]與肝失疏泄病機(jī)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[17-22]，保持穩(wěn)態(tài)為肝主疏泄核心，動(dòng)機(jī)和情緒中樞大腦邊緣系統(tǒng)為肝主疏泄調(diào)控中樞；下丘腦—垂體—腎上腺軸是其信息通路；平滑肌系統(tǒng)是肝主疏泄功能得以實(shí)現(xiàn)的效應(yīng)器。嚴(yán)燦等[22]也認(rèn)為肝失疏泄的中樞神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制與調(diào)節(jié)下丘腦—垂體—腎上腺軸有關(guān)。而眼壓波動(dòng)正是由下丘腦—垂體—腎上腺軸調(diào)控，與皮質(zhì)類固醇有關(guān)，血漿皮質(zhì)類固醇水平與眼壓呈正相關(guān)[23]，眼壓峰值出現(xiàn)于血漿皮質(zhì)類固醇達(dá)到峰值水平后3～4 h，干擾皮質(zhì)類固醇周期可改變眼壓的波動(dòng)曲線，口服皮質(zhì)類固醇合成抑制藥可降低眼壓水平。

大鼠具有同人類一樣的晝夜眼壓波動(dòng)現(xiàn)象。馬建洲等[24]報(bào)道大鼠的眼壓同正常人群眼壓分布規(guī)律一樣，均呈高斯分布，24 h眼壓波動(dòng)范圍為 （3.12±1.19）mm Hg。上午眼壓較低，然后逐漸升高，晚間眼壓明顯高于白天眼壓，隨后回落至基礎(chǔ)眼壓，如此循環(huán)。Carla JAbbott等[25]對清醒狀態(tài)的挪威大鼠進(jìn)行配合訓(xùn)練后，用TonoLab眼壓計(jì)測量，基線水平也在20 mm Hg左右。以往對于大鼠基線眼壓的測量，因受到測量儀器和是否麻醉的影響，報(bào)道結(jié)果不一致。Moore[26]報(bào)道大鼠平均眼壓為（15.20±1.23）mm Hg。本研究采用Tono-Pen AVIA手持式眼壓計(jì)，對42只SD大鼠用桌面式小動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉后，基線眼壓為（15.94±1.56） mm Hg，與上述眼壓值接近。

結(jié)合對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的具體應(yīng)用，本研究對實(shí)驗(yàn)大鼠的眼壓測量總結(jié)為：樣本量小時(shí)，對大鼠進(jìn)行充分的行為訓(xùn)練測得的眼壓數(shù)值最可靠；而當(dāng)樣本量較大時(shí)，應(yīng)用異氟醚或七氟醚吸入麻醉更為實(shí)際，且考慮其對其他系統(tǒng)影響小，蘇醒快的特點(diǎn)，眼壓數(shù)值亦較為可靠。