對(duì)甘薯快繁體系的優(yōu)化

任清銘，王 喆，2，趙 娟，王育選，張 彬，2，3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所，山西太谷030801；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

甘薯是我國(guó)四大主要糧食作物之一，也是飼料和輕工業(yè)的重要原料。但甘薯是無(wú)性繁殖作物，在種植過(guò)程中極易感染病毒，目前，在甘薯上主要通過(guò)莖尖分生組織培養(yǎng)來(lái)脫離病毒，因此，甘薯的脫毒和快速繁殖成為甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)[1-3]。

自20 世紀(jì)末期NIELSEN[4]報(bào)道用甘薯莖尖分生組織培育出無(wú)病毒植株后，國(guó)內(nèi)外掀起了甘薯病毒病防治和甘薯組培快繁研究的熱潮[1-3，5-6]。一種合理的快速繁殖方式不僅可以節(jié)約大量的成本，同時(shí)還能大幅縮減脫毒甘薯種苗投入到實(shí)際生產(chǎn)中所需要的時(shí)間，但是相關(guān)研究目前都未達(dá)到理想的效果[1-2，7-9]。

本研究通過(guò)探索各種外源激素作用于甘薯的不同部位時(shí)對(duì)其各生長(zhǎng)階段的影響，旨在優(yōu)化甘薯脫毒苗的快繁體系，為甘薯的工廠化快速繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為紅東和秦薯5 號(hào)的脫毒苗。

1.2 試驗(yàn)方法

表1 培養(yǎng)基配方 mg/L

先將培養(yǎng)基中的種苗在MS 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，然后選擇生長(zhǎng)狀況良好的試管苗，分別切取它的莖尖、主莖（主莖的切取分2 種方式，一種為雙葉莖段，一種為單葉莖段），長(zhǎng)度為1.5～2.0 cm。在MS基本培養(yǎng)基上分別添加不同質(zhì)量濃度的NAA（0.2，0.4，0.6，0.8 mg/L）、6-BA（0.2，0.4，0.6，0.8 mg/L）和IAA（0.2，0.4，0.6，0.8 mg/L）（表1）。以MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，瓊脂用量5 g/L，蔗糖用量30 g/L，pH 值為5.8。

將接種后的培養(yǎng)基置于光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx、光照時(shí)間為14 h/d、溫度為25 ℃且相對(duì)濕度在70%的日光培養(yǎng)室中。每個(gè)處理接種20 個(gè)材料，重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，并以各階段的顯著特征來(lái)表示其生長(zhǎng)狀況。前7 d 每天觀察并記錄其在細(xì)微處的變化，之后每5 d 記錄一次它們的詳細(xì)變化，直到它們最后一株有能力分化成完整植株的植株分化完成為止。記錄數(shù)據(jù)并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行整理分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

試驗(yàn)分別測(cè)定不同品種不同處理的生根時(shí)間、成苗時(shí)間和成苗率，并計(jì)算其繁殖系數(shù)。其中，成苗標(biāo)準(zhǔn)為擁有完整植株體系且具有5 片及5 片以上展開(kāi)的葉片；成苗時(shí)間為每次試驗(yàn)最后一株可分化成完整植株的植株達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的平均時(shí)間；生根時(shí)間為每次試驗(yàn)可以達(dá)到成苗標(biāo)準(zhǔn)的植株里面最晚發(fā)根的植株生根所需時(shí)間的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源激素對(duì)秦薯5 號(hào)快速繁殖的影響

從表2，3，4 可以看出，在對(duì)秦薯5 號(hào)不同接種部位進(jìn)行不同激素處理后，其雙葉莖段的成苗時(shí)間和生根時(shí)間最短，成苗率最高，但由于是以甘薯的雙葉莖段作為繼代的材料，所以其繁殖系數(shù)較低；單葉莖段的成苗時(shí)間與莖尖比較接近，但其生根時(shí)間要略短于莖尖，雖然其成苗率略低于雙葉莖段，但是其繁殖系數(shù)最高。莖尖的生根時(shí)間是所選部位中最長(zhǎng)的，同時(shí)其成苗率也是最低的，在前期生長(zhǎng)過(guò)程中底部容易膨大生成愈傷組織，從而影響其后期的生長(zhǎng)發(fā)育。

表2 不同激素對(duì)秦薯5 號(hào)莖尖快速繁殖的影響

表3 不同激素對(duì)秦薯5 號(hào)雙葉莖段快速繁殖的影響

表4 不同激素對(duì)秦薯5 號(hào)單葉莖段快速繁殖的影響

一定濃度的IAA 對(duì)秦薯5 號(hào)的成苗時(shí)間、生根時(shí)間、成苗率和繁殖系數(shù)都有所促進(jìn)作用，其中，以0.2 mg/L 處理效果最佳，隨著IAA 質(zhì)量濃度的遞增促進(jìn)效果減弱，當(dāng)IAA 質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg/L 時(shí)開(kāi)始呈現(xiàn)出抑制的效果。6-BA 對(duì)莖尖的生根時(shí)間影響最為明顯，嚴(yán)重抑制了莖尖前期的生根，同時(shí)莖尖底部會(huì)先膨大生成愈傷組織（圖1，2），嚴(yán)重影響了莖尖的成苗效果；當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/L 時(shí)各部位的繁殖系數(shù)最低，嚴(yán)重影響了甘薯的繼代培養(yǎng)。NAA 對(duì)秦薯5 號(hào)各部位繼代培養(yǎng)的效果最差，基本上都起抑制作用，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度到達(dá)0.8 mg/L時(shí)秦薯5 號(hào)的成苗時(shí)間和生根時(shí)間均最長(zhǎng)。

因此，IAA 對(duì)秦薯5 號(hào)的快速繁殖效果最為明顯，結(jié)合生長(zhǎng)素的特性（生長(zhǎng)素濃度較低時(shí)可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，濃度相對(duì)較高時(shí)會(huì)抑制生長(zhǎng)，同一植株不同部位的細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素的敏感度不同）可以判斷，當(dāng)IAA 質(zhì)量濃度低于0.6 mg/L 時(shí)，MS＋I(xiàn)AA 培養(yǎng)基對(duì)秦薯5 號(hào)的快速繁殖具有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中，0.2 mg/L 的IAA 處理雙葉莖段的生長(zhǎng)速度最快，但從生產(chǎn)角度來(lái)講，以0.2 mg/L 的IAA 來(lái)處理單葉莖段，其繁殖速度最快，同時(shí)其經(jīng)濟(jì)效益也最好。

2.2 不同外源激素對(duì)紅東快速繁殖的影響

由表5，6，7 可知，在對(duì)紅東的不同接種部位進(jìn)行不同激素處理后，紅東雙葉莖段的成苗時(shí)間和生根時(shí)間上的優(yōu)勢(shì)與秦薯5 號(hào)相同，繁殖系數(shù)同樣較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)上的快速繁殖。而且紅東的單葉莖段快繁和莖尖在各方面都出現(xiàn)了問(wèn)題，不過(guò)單葉 莖段的繁殖系數(shù)依然最高。

表5 不同外源激素對(duì)紅東莖尖快速繁殖的影響

表6 不同外源激素對(duì)紅東雙葉莖段快速繁殖的影響

表7 不同外源激素對(duì)紅東單葉莖段快速繁殖的影響

與秦薯5 號(hào)相反，對(duì)于紅東快速繁殖效果最好的是NAA，所有添加了NAA 的處理，其成苗時(shí)間、生根時(shí)間都有所縮短，且成苗率都有一定幅度的提升。在NAA 質(zhì)量濃度為0.4 mg/L 時(shí)，效果最為顯著，特別是對(duì)于莖尖繼代，其生根時(shí)間、成苗率、成苗時(shí)間基本都達(dá)到本試驗(yàn)的最優(yōu)值。IAA 只有在最低質(zhì)量濃度（0.2 mg/L）時(shí)對(duì)雙葉莖段有促進(jìn)作用，其余濃度處理都對(duì)紅東的繼代培養(yǎng)產(chǎn)生了抑制作用，使成苗時(shí)間和生根時(shí)間延長(zhǎng)，成苗率和繁殖系數(shù)降低。6-BA 對(duì)紅東的效果與秦薯5 號(hào)相差不大，都是低質(zhì)量濃度（0.2 mg/L）時(shí)促進(jìn)，然后隨著質(zhì)量濃度的增加促進(jìn)效果減弱，在到達(dá)一定質(zhì)量濃度（0.4 mg/L）時(shí)呈現(xiàn)為抑制作用，不過(guò)抑制效果要低于IAA。

從生長(zhǎng)狀況來(lái)講，紅東雙葉莖段在MS＋0.4 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上效果最好，但從生產(chǎn)的角度來(lái)講，紅東單葉莖段在MS＋0.2 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上快速繁殖效果最佳。雖然高濃度的6-BA 抑制了植株的生根和成苗，但是它在繼代以后可以促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，不過(guò)容易生成愈傷組織，最后會(huì)成為底部帶有部分愈傷的成苗（圖3，4），因此，可以考慮用低濃度的6-BA 搭配其他激素使用。

3 結(jié)論與討論

甘薯的快速繁殖一般以無(wú)激素的MS 基本培養(yǎng)基為主，周期一般為30 d 左右[8-10]，而且現(xiàn)在甘薯的組織培養(yǎng)已經(jīng)發(fā)展得較為成熟，可以從莖、葉柄、葉片、花藥、子房以及塊根等部位進(jìn)行培養(yǎng)[11-12]，只是芽的分化率和植株再生頻率都比較低，如果在甘薯快速繁殖的過(guò)程中加入合適的生長(zhǎng)素類(lèi)似物，會(huì)在一定程度上促進(jìn)植株的生根和成苗，但由于植物不同品種對(duì)生長(zhǎng)素類(lèi)似物的敏感程度不同，所以需要提前對(duì)其進(jìn)行篩選，找到合適的外源激素濃度配比培養(yǎng)基來(lái)適應(yīng)甘薯外植體全能性的表達(dá)，從而提升甘薯芽的分化率和植株再生頻率[10]。孟令文[13]研究表明，激素促進(jìn)外植體快速生長(zhǎng)的機(jī)制可能是因?yàn)榧尤肓松L(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)后加速了甘薯的生根，而根的形成又促進(jìn)了植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而優(yōu)化了植株的生長(zhǎng)。

根據(jù)秦梅等[11]和謝穎[14]的研究，在MS 培養(yǎng)基內(nèi)加入6-BA 后會(huì)使莖段下部形成愈傷組織，減少生根數(shù)，延長(zhǎng)生根時(shí)間，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢、成苗率降低。本次試驗(yàn)在MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6-BA 后雖然生根緩慢，生長(zhǎng)前期底部會(huì)先形成愈傷組織，但卻有利于腋芽的萌發(fā)，若此培養(yǎng)基加入抑制愈傷組織形成的激素可能會(huì)效果更好。從生產(chǎn)的角度來(lái)講，追求操作簡(jiǎn)單、成本低廉，多種激素的配合使用固然會(huì)效果顯著，可是其違背了生產(chǎn)的原則，所以暫時(shí)不作考慮。

張寶紅等[15]研究表明，在塊根植物組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)添加細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)（KT、ZT、6-BA等），可以在促進(jìn)根形成的同時(shí)抑制芽的生成。朱愛(ài)科等[16]研究表明，高濃度的6-BA 抑制了根的發(fā)生，也未能促進(jìn)芽的分化，提高細(xì)胞分裂素濃度也未有芽的形成?？墒潜驹嚢l(fā)現(xiàn)，微量細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)不僅可以促進(jìn)根的形成，同時(shí)還能促進(jìn)芽的生成?？赡苁且?yàn)檫x擇的品種存在差異，因此結(jié)果不同。

本試驗(yàn)中，IAA 和NAA 在不同的品種中表現(xiàn)出不同的優(yōu)勢(shì)，而孫榕[10]和蔣明權(quán)[17]曾研究得出過(guò)這2 種激素對(duì)甘薯的促進(jìn)作用的結(jié)論。雖然這2 種激素對(duì)試驗(yàn)中這2 個(gè)品種的敏感度不同，但都起到了促進(jìn)作用，結(jié)合生長(zhǎng)素的特性可以推斷出，秦薯5 號(hào)對(duì)NAA 比較敏感，紅東對(duì)IAA 比較敏感，可能是因?yàn)樯L(zhǎng)素類(lèi)似物NAA 是由人工合成、功能與生長(zhǎng)素相似的化合物，其與生長(zhǎng)素的作用過(guò)程有一定的差異。根據(jù)生長(zhǎng)素的酸生長(zhǎng)學(xué)說(shuō)和基因表達(dá)學(xué)說(shuō)[22]，其中有生長(zhǎng)素與受體結(jié)合的過(guò)程，可能是在此過(guò)程中生長(zhǎng)素和生長(zhǎng)素類(lèi)似物與受體的結(jié)合存在一定的差異性，從而導(dǎo)致不同品種對(duì)NAA 和IAA的敏感度不同。

徐飛等[18]研究表明，在使用外源激素時(shí)，其效果受植物內(nèi)源激素的種類(lèi)、分布及濃度的影響。而甘薯品種和繼代的部位不同，也就意味著其內(nèi)源激素的種類(lèi)、濃度及分布存在著差異，這也可以作為2 個(gè)品種在面對(duì)同一種外源激素時(shí)表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象的依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，對(duì)于秦薯5 號(hào)來(lái)說(shuō)，以MS＋0.2 mg/L 的IAA 作為單葉莖段培養(yǎng)基，其繁殖速度最快，與MS 培養(yǎng)基相比，繁殖系數(shù)增長(zhǎng)了7.0%，成苗時(shí)間縮短了6.3%，生根時(shí)間縮短了46.5%，成苗率增長(zhǎng)了5.9%。而對(duì)于紅東來(lái)說(shuō)，單葉莖段在MS＋0.2 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上快速繁殖效果最佳，繁殖系數(shù)增長(zhǎng)了6.7%，成苗時(shí)間縮短了18.5%，生根時(shí)間縮短了27.0%，成苗率增長(zhǎng)了5.6%。相比關(guān)崇梅[8]、謝穎[14]、周志林等[19]、趙秀芳[20]、孫光澤等[21]的研究結(jié)果，本研究在成苗時(shí)間、生根時(shí)間和成苗率等方面都有了顯著的提升。