許婷 陳志剛 覃漢俊 吳航天 余斌 崔壯** 胡巖君**

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院呼吸睡眠中心，廣州 510515；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨科，廣州 510700；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣州 510515）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）發(fā)病過程中，軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨相互作用，形成一個功能體[1-7]。OA的特征是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變、軟骨下骨的硬化、關(guān)節(jié)周圍骨刺的形成[8-11]。目前針對OA 沒有特別有效的治療方法，關(guān)節(jié)置換是骨關(guān)節(jié)炎晚期患者必須面臨的選擇[12]。OA發(fā)病機制仍不清楚。近期越來越多的證據(jù)表明，在OA發(fā)病過程中，軟骨下骨為關(guān)節(jié)軟骨提供力學(xué)支撐。軟骨下骨異常的骨吸收能夠改變關(guān)節(jié)軟骨正常的力學(xué)環(huán)境，從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性病變，最終導(dǎo)致OA[13]。Th17 細(xì)胞是一種促進骨吸收的輔助T細(xì)胞，能通過分泌IL17誘導(dǎo)核因子κB受體活化子配體的表達(dá)，進而促進破骨細(xì)胞的分化[14-16]。軟骨下骨過度骨吸收，使沉積于軟骨下骨骨基質(zhì)中的成骨和破骨偶聯(lián)因子過度釋放，進而誘導(dǎo)非偶聯(lián)的骨重塑，即成骨不在骨吸收部位，導(dǎo)致軟骨下骨的異位成骨，改變關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)力[13]。常山酮是從中藥常山中提取的一種喹唑啉酮生物堿，早在2000多年前常山就被用作抗瘧疾藥物[17]。近期研究表明常山酮能夠抑制Th17細(xì)胞分化[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，全身給予常山酮能夠通過抑制Th17 細(xì)胞來抑制OA 的進展[19]?；诶碚摚很浌窍鹿钱愇还腔贠A發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用；Th17細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收促進軟骨下骨異位成骨發(fā)生。提出假設(shè)：局部給予常山酮抑制軟骨下骨Th17細(xì)胞能抑制OA發(fā)病及進展。但目前軟骨下骨局部給藥仍是一個難點和挑戰(zhàn)。本研究提出將滲透性輸液泵置入軟骨下骨，以實現(xiàn)軟骨下骨定量、持續(xù)和穩(wěn)定的局部給藥方式。本研究旨在探討通過滲透性輸液泵局部給藥常山酮，是否能夠抑制軟骨下骨Th17細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收進而抑制OA進展，以及潛在機制，為OA的預(yù)防和臨床治療提供新的技術(shù)思路和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及OA模型建立

從南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買3月齡SD大鼠30 只，分3 組：假手術(shù)組（10 只）、OA 組（10 只）、常山酮組（10 只）。OA 組和常山酮組骨關(guān)節(jié)炎模型通過切斷膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶誘導(dǎo)。目前在OA研究中，前交叉韌帶離斷（anterior cruciate ligament transection,ACLT)模型是常用并被廣泛認(rèn)可的模型。大鼠乙醚吸入麻醉后，在顯微鏡下切開皮膚及皮下組織，暴露髕骨，髕骨內(nèi)側(cè)緣分離髕內(nèi)側(cè)組織，將髕骨外翻，暴露膝關(guān)節(jié)內(nèi)前交叉韌帶。OA 組和常山酮組顯微剪剪斷前交叉韌帶，而后予關(guān)節(jié)囊和皮膚縫合；假手術(shù)組不剪斷前交叉韌帶，關(guān)節(jié)囊切開后便予皮膚縫合。術(shù)后大鼠放在電暖墊上復(fù)蘇。

1.2 軟骨下骨滲透性輸液泵置入

大鼠造模后即刻置入滲透性輸液泵，沿手術(shù)造模切口，分離膝外側(cè)皮下組織。緊貼髕骨外側(cè)緣及脛骨平臺前下方剝離脛骨前肌群附著點。為避免直接將滲透性輸液泵插入軟骨下骨導(dǎo)致的輸液泵針管堵塞，在插入輸液泵前首先用一個1 ml注射器針頭由脛骨平臺前下方斜向內(nèi)上方插入；采用多模式小動物活體成像系統(tǒng)（FX Pro，Bruker）拍攝小鼠膝關(guān)節(jié)側(cè)位片，確認(rèn)針頭進入軟骨下骨深度。本研究以針頭剛好進入軟骨下骨為準(zhǔn)，以免損傷軟骨下骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，對實驗產(chǎn)生影響。拔出針頭，測量針頭進入深度。將滲透性輸液泵（Alzet model 1004，0.11 μl/h，28 d）沿預(yù)先針頭插入的通道進入，插入深度同針頭測量深度。然后將掀起的脛骨前肌覆蓋于針尾，縫合固定。常山酮給藥28 d，期間泵入軟骨下骨常山酮量為0.2 μg（配制溶液濃度1 μg/370 μl）。大鼠實驗過程中未出現(xiàn)死亡。大鼠術(shù)后2個月予安樂死。取材檢測。

1.3 micro-CT 掃描

取大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本去除膝周肌肉軟組織，固定于70%酒精過夜。采用高分辨率的micro-CT（Sky-Scan 1172）對標(biāo)本進行掃描，同時使用圖像重建軟件（NRecon v1.6)進行掃描圖片重建。標(biāo)本分析采用數(shù)據(jù)分析軟件（CTAn v1.9）和三維可視軟件（μ CTVol v2.0）。掃描電壓設(shè)置為50 kVp、電流200 μA、每像素5.8 μm 分辨率，進行分析的三維圖片為大鼠脛骨軟骨下骨矢狀位片。定義興趣區(qū)域為整個脛骨軟骨下骨內(nèi)側(cè)部分。分析指標(biāo)包括：軟骨下骨骨體積與組織體積比值（BV/TV）、松質(zhì)骨模式因子（Tb.Pf）、松質(zhì)骨數(shù)量（Tb.N）及軟骨下骨板厚度（SBP.Th）。

1.4 免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色

大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本固定于4%福爾馬林48 h，10%乙二胺四乙酸（PH 7.4）脫鈣4 周。分別使用石蠟和冰凍包埋。石蠟包埋用于免疫組織化學(xué)染色。冰凍包埋用于免疫熒光染色。標(biāo)本切片為內(nèi)側(cè)縱行切片，切片厚度為4 μm。免疫組織化學(xué)使用蘇木精進行復(fù)染。免疫熒光染色將標(biāo)本孵于一抗后，4℃過夜，次日加帶有熒光標(biāo)記的二抗，常溫下1 h，同時避光。使用共聚焦顯微鏡對染色進行觀察和攝片（Olympus DP71）。數(shù)據(jù)計數(shù)和定量分析采用雙盲方式，分析軟件為ImageJ（ImageJ 1.51j8）。對整個軟骨下骨的陽性細(xì)胞進行計數(shù)，同時各組每個大鼠觀察連續(xù)5張染色片取平均數(shù)。采用文獻提供的國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）評分方法對關(guān)節(jié)軟骨進行評分[20]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。先進行方差齊性和正態(tài)性檢驗，再使用單因素方差分析進行組間比較，方差齊用LSD檢驗，不齊用DunnettT3檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨下骨給予常山酮抑制ACLT大鼠關(guān)節(jié)軟骨退行性變

依據(jù)實驗方法構(gòu)建ACLT OA模型及在大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨置入滲透性輸液泵（圖1）。關(guān)節(jié)軟骨番紅固綠染色顯示不同組別關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生變化（圖2）。OA 組關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)明顯退行性病變，而軟骨下骨給予常山酮抑制了關(guān)節(jié)軟骨的退行性變。同時發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞由深層到淺層，圖2B箭頭示軟骨下骨深層首先開始軟骨骨化，而表面關(guān)節(jié)軟骨仍完整。OARSI評分示OA組較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05)；軟骨下骨給予常山酮顯著降低軟骨OARSI評分（P＜0.05)。

2.2 軟骨下骨給予常山酮抑制軟骨下骨Th17細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收

進一步探討局部給予常山酮抑制軟骨退行性變的機制。ACLT大鼠軟骨下骨Th17細(xì)胞明顯升高，局部給予常山酮抑制了Th17細(xì)胞的增加（P＜0.05，圖3、4）。Th17細(xì)胞能夠通過分泌IL17促進破骨細(xì)胞的分化[5]。本實驗結(jié)果與之類似，OA組TRAP+破骨細(xì)胞較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05)；而軟骨下骨給予常山酮顯著降低了軟骨下骨TRAP+破骨細(xì)胞（P＜0.05，圖5）。

2.3 軟骨下骨給予常山酮維持軟骨下骨正常的骨顯微結(jié)構(gòu)

圖1 軟骨下骨置入滲透性輸液泵

圖2 三組關(guān)節(jié)軟骨變化情況

通過micro-CT掃描確認(rèn)軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)的變化情況。分析指標(biāo)包括：軟骨下骨骨體積與組織體積比值（BV/TV）、松質(zhì)骨模式因子（Tb.Pf）、松質(zhì)骨數(shù)量（Tb.N）及軟骨下骨板厚度（SBP.Th）。與假手術(shù)組比較，ACLT升高了軟骨下骨Tb.Pf（P＜0.05），同時降低了BV/TV（P＜0.05）、SBP.Th（P＜0.05）及Tb.N（P＜0.05）。滲透性輸液泵局部給予常山酮逆轉(zhuǎn)了軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)變化，使其類似假手術(shù)組（圖6、7）。該結(jié)果表明軟骨下骨局部給予常山酮能夠通過抑制Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，維持軟骨下骨正常的骨顯微結(jié)構(gòu)，進而保護關(guān)節(jié)軟骨，抑制OA進展。

3 討論

圖3 三組軟骨下骨Th17細(xì)胞表達(dá)定量分析

圖4 三組軟骨下骨Th17細(xì)胞表達(dá)情況

圖5 不同組間軟骨下骨TRAP+破骨細(xì)胞表達(dá)情況

越來越多研究者開始重視軟骨下骨病變在OA發(fā)病中的作用。既往研究[21-25]顯示，在OA 發(fā)病過程中，軟骨下骨的病變早于關(guān)節(jié)軟骨。OA 發(fā)病過程中因各種原因?qū)е萝浌窍鹿枪俏?，引起軟骨下骨非偶?lián)骨重塑，進而引起關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力改變導(dǎo)致退行性變。近期研究[26,27]表明，使用抗骨質(zhì)疏松藥物能夠抑制OA 進展。軟骨下骨與關(guān)節(jié)軟骨是一個相互作用的功能體[1]，軟骨下骨為關(guān)節(jié)軟骨提供力學(xué)支撐。軟骨下骨異常的骨吸收誘導(dǎo)的非偶聯(lián)骨重塑導(dǎo)致軟骨下骨異位骨島的形成，引起關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力改變[13]。關(guān)節(jié)軟骨在異常應(yīng)力刺激下，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞生物力學(xué)發(fā)生改變。軟骨細(xì)胞合成代謝下降，分解代謝增加，如基質(zhì)金屬蛋白酶等分泌增加，促進了關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)的分解，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性病變。因此局部抑制軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)的改變，可能有保護關(guān)節(jié)軟骨，抑制OA進展的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過滲透性輸液泵在軟骨下骨予以局部給予常山酮，抑制了關(guān)節(jié)軟骨的退行性變。通過番紅固綠染色發(fā)現(xiàn)，ACLT導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨OARSI 評分顯著升高，而軟骨下骨給予常山酮顯著降低了OARSI評分。關(guān)節(jié)軟骨在膝關(guān)節(jié)位于骨端覆蓋于軟骨下骨上。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞、糖蛋白及Ⅱ型膠原纖維等構(gòu)成。關(guān)節(jié)軟骨中無血管等組織，糖蛋白在關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)揮著分子海綿的作用，控制著關(guān)節(jié)軟骨水分和營養(yǎng)物質(zhì)的攝入和排出[28]。Ⅱ型膠原纖維為關(guān)節(jié)軟骨提供支架，維持著關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)完整。OA 發(fā)病過程中，由于關(guān)節(jié)軟骨在異常應(yīng)力刺激下導(dǎo)致分解代謝增加，促進了Ⅱ型膠原纖維及糖蛋白的裂解。同時發(fā)現(xiàn)軟骨破壞由深層向淺層進展，深層關(guān)節(jié)軟骨糖蛋白表達(dá)減少，而表層關(guān)節(jié)軟骨仍完整，進一步表明關(guān)節(jié)軟骨的退行性變由軟骨下骨誘導(dǎo)。

圖6 三組軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)

軟骨下骨Th17細(xì)胞調(diào)控軟骨下骨骨吸收[14]。既往研究[29]表明，Th17細(xì)胞能夠調(diào)控破骨細(xì)胞分化進而促進骨吸收。Th17 細(xì)胞通過分泌IL17，促進骨基質(zhì)細(xì)胞分泌RANKL 表達(dá)，進而促進破骨細(xì)胞的分化[14,30]。前期研究[19]表明，全身給予常山酮能夠抑制軟骨下骨Th17 細(xì)胞。但全身給藥有一定局限性，如不可預(yù)知的副作用，會限制在臨床中的應(yīng)用。同時軟骨下骨局部給藥抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化目前仍不清楚。本研究提出了局部軟骨下骨給藥的新方法，即將滲透性輸液泵置入軟骨下骨，以實現(xiàn)軟骨下骨定量、持續(xù)和穩(wěn)定的局部給藥。本研究發(fā)現(xiàn)，通過滲透性輸液泵在軟骨下骨局部給予常山酮，能夠抑制軟骨下骨Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，TRAP+破骨細(xì)胞表達(dá)明顯降低。

抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收可以維持軟骨下骨骨纖維結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，在OA 發(fā)病過程中，軟骨下骨BV/TV、Tb.N 及SBP.Th 顯著降低，Tb.Pf 顯著升高。Tb.Pf 為軟骨下骨模式因子，反映的是軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)及骨連接性破壞情況。因而Tb.Pf 值升高，表明軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)破壞加重，即非偶聯(lián)骨重塑占據(jù)主導(dǎo)[13]。非偶聯(lián)骨重塑導(dǎo)致軟骨下骨骨形成不在骨吸收的部位，從而導(dǎo)致骨吸收的部位出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，而非成骨部分出現(xiàn)成骨如骨刺形成。因而最終導(dǎo)致軟骨下骨骨體積BV降低，而組織體積TV增大，即BV/TV 降低；軟骨下骨骨小梁及軟骨下骨生長板SBP 進行著過度的骨吸收，同時成骨非偶聯(lián)，因而導(dǎo)致骨小梁數(shù)量Tb.N降低及SBP.Th變薄。而軟骨下骨給予常山酮能夠維持軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)，從而維持了關(guān)節(jié)軟骨的正常受力。

圖7 三組軟骨下骨骨顯微結(jié)構(gòu)定量分析

本研究為了避免直接將滲透性輸液泵插入軟骨下骨導(dǎo)致的輸液泵針管堵塞，在插入輸液泵前首先用一個1 ml注射器針頭由脛骨平臺前下方斜向內(nèi)上方插入，再沿預(yù)先針頭插入的通道插入滲透性輸液泵。本研究以針頭剛好進入軟骨下骨為準(zhǔn)，以最大程度避免損傷軟骨下骨骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。同時在常山酮組通過輸液泵給藥常山酮的同時，也在OA組通過輸液泵給予常山酮溶劑。研究結(jié)果表明軟骨下骨給予常山酮抑制了OA組軟骨下骨及關(guān)節(jié)軟骨的相應(yīng)變化。

由于OA發(fā)病機制目前仍不完全清楚，OA目前的治療目的是緩解疼痛，延緩疾病進展[31]。早期軟骨下骨給藥抑制軟骨下骨異常骨重塑而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退行性變，為OA患者的治療提供新的視點。臨床可通過MRI篩查非炎癥性關(guān)節(jié)疼痛患者軟骨下骨病灶，進而在臨床實時透視設(shè)備的輔助下，精準(zhǔn)定點取出病灶，同時將滲透性給藥泵置入并固定，或置入載藥可吸收復(fù)合體填充骨缺損。本研究亦有一定局限性。軟骨下骨給藥更適用于OA早期患者，因其抑制早期軟骨下骨異常骨重塑。但目前醫(yī)療環(huán)境下，骨關(guān)節(jié)炎早期診斷仍然存在諸多問題。在我國很多OA患者一般在疾病晚期關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重時才到醫(yī)療機構(gòu)就診，因而也影響OA保守治療的療效。因此確定早期OA診斷標(biāo)準(zhǔn)及患者健康教育普及也尤為重要。但本研究仍為OA的預(yù)防及臨床治療提供新的思路和理論支撐。