劉 普 張麗娜 張江磊 王 玉 劉夢夢 許世靖 喬明明 鄧瑞雪

(河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院;洛陽市天然產(chǎn)物功能因子研究及產(chǎn)品開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471023)

牡丹籽油是一種新開發(fā)的食用油脂，含有豐富的不飽和脂肪酸，具有較好營養(yǎng)價(jià)值，被認(rèn)為是植物油中的珍品[1-5]。目前，經(jīng)國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)可以作為牡丹籽油制備原料的油用牡丹僅有鳳丹牡丹(Paeoniaostii)和紫斑牡丹(P.rockii)2個(gè)品種[1,6]。我國食用油資源相對短缺，食用油對外依存度已超過60%[7]，因此研究開發(fā)新的食用油脂資源對于維護(hù)國家的糧油安全具有重要意義。我國油用牡丹資源豐富，山東菏澤、河南洛陽、四川彭州、安徽亳州和銅陵、甘肅臨夏以及湖南湘西等地均有大面積的油用牡丹種植，且種植面積在逐年增大[8]。作為一種新型的木本油料作物，油用牡丹的廣泛種植和應(yīng)用可以在一定程度上緩解我國食用油資源短缺的現(xiàn)狀。

牡丹籽油中的不飽和脂肪酸含量約占總脂肪酸含量的90%，可以滿足人體對不飽和脂肪酸的需求[9-10]。但不飽和程度過高，也導(dǎo)致了牡丹籽油在生產(chǎn)和貯存過程中容易受到光、熱、氧氣等作用而發(fā)生氧化性酸敗，致使其本身風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值遭到破壞[11]。目前，關(guān)于牡丹籽油天然抗氧化劑的系統(tǒng)研究開發(fā)的文獻(xiàn)較少[11]。研究牡丹籽油在加工和貯存過程中氧化穩(wěn)定性問題是牡丹籽油研究開發(fā)應(yīng)用的前提，對于牡丹籽油相關(guān)深加工產(chǎn)品深入研究開發(fā)具有重要意義。

以天然食品抗氧化劑取代化學(xué)合成抗氧化劑是今后食品抗氧化劑工業(yè)發(fā)展的趨勢，開發(fā)實(shí)用、高效、成本低廉的天然抗氧化劑仍是重要的研究方向。對于抗氧化活性成分及其效果，各抗氧化活性之間協(xié)同作用，以及抗氧化機(jī)制、化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗氧化性及穩(wěn)定性的相關(guān)性等的研究將是未來研究的重點(diǎn)[12]。我國有著非常豐富的天然抗氧化劑資源，多酚類物質(zhì)作為天然抗氧化劑顯示了良好的應(yīng)用范圍，天然食品抗氧化劑將有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究采用Schaal烘箱耐熱試驗(yàn)法，以人工合成抗氧化劑二叔丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚和特丁基對苯二酚為陽性對照，研究分析了幾種天然抗氧化劑及增效劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響，比較了不同抗氧化劑之間的復(fù)合抗氧化作用效果。并根據(jù)范特霍夫規(guī)則，對牡丹籽油在20 ℃條件下的儲存時(shí)間進(jìn)行了預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油用牡丹籽采自洛陽市嵩縣車村鎮(zhèn)油用牡丹種植基地，原植物為鳳丹牡丹(Paeoniaostii)。鳳丹牡丹籽脫殼后得牡丹籽仁，經(jīng)機(jī)械壓榨法制備牡丹籽油，保存于-20 ℃的冰箱中，備用。

磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、苯甲酸、磷酸二氫鉀、鎢酸鈉、無水碳酸鈉、溴素、磷酸、磷鉬酸、冰乙酸、碘化鉀、檸檬酸(CA)、鉬酸鈉、氯仿等試劑均為分析純。

脂溶性迷迭香、水溶性迷迭香、茶多酚、蘋果多酚、葡萄多酚、維生素C(VC)、沒食子酸、生育酚、BHT、BHA、TBHQ、牡丹籽多酚、野葡萄籽多酚。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600-PC 紫外-可見分光光度計(jì)；HANGPING FA2004電子天平；BPH-9082精密恒溫培養(yǎng)箱；UV-1800型紫外分光光度計(jì)；ULUP-III-10T優(yōu)普系列超純水器。

1.3 方法

1.3.1 多酚類化合物含量測定

采用Folin-Ciocalteu試劑法[13-14]來測定天然抗氧化劑中的多酚類化合物的含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測波長為750 nm。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

分別取一定量的天然抗氧化劑，用甲醇溶解，配成一定濃度的儲備溶液。分別取儲備液1.0 mL到100 mL的容量瓶中，各加入60 mL水，再加入5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合均勻，然后再分別加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，加水定容。將混合溶液在20 ℃放置30 min后，在波長為750 nm下測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出天然抗氧化劑中多酚類化合物相當(dāng)于沒食子酸的量。

1.3.2 牡丹籽多酚的制備

由于油用牡丹籽殼中含有豐富的多酚類化合物，具有較好的抗氧化活性作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)將油用牡丹籽殼多酚作為一種天然抗氧化劑來應(yīng)用。

取本實(shí)驗(yàn)研究中脫殼得到的油用牡丹籽殼，粉碎，加入10倍質(zhì)量的體積份數(shù)為95%乙醇，在50 ℃的條件下超聲提取20 min?；厥仗崛∫?，減壓濃縮得浸膏。將浸膏用100倍質(zhì)量的水充分溶解，過濾，濾液用大孔吸附樹脂充分吸附，裝柱，先用水洗脫，再用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇分別洗脫，測定各洗脫液多酚含量。收集多酚含量最高的餾分段，減壓蒸餾，即牡丹籽殼多酚提取物，備用。

1.3.3 野葡萄籽多酚的制備

野葡萄也含有較多的多酚類化合物。由于豫西伏牛山區(qū)野葡萄資源豐富，具有較大的研究開發(fā)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)將野葡萄籽多酚也作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用。

取野葡萄(VitispiasezkiiMaxim)籽，采用壓榨法去除其中所含的油脂。將榨油后剩余的籽餅粕干燥至恒重，粉碎，加入10倍質(zhì)量的體積份數(shù)為95%乙醇，在50 ℃的條件下超聲提取20 min。回收提取液，減壓濃縮得浸膏。將浸膏用100倍質(zhì)量的水充分溶解，過濾。濾液用大空吸附樹脂充分吸附，裝柱，先用水洗脫，再用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇分別洗脫，測定各洗脫液多酚含量。收集多酚含量最高的餾分段，減壓蒸餾，即野葡萄多酚提取物，備用。

1.3.4 過氧化值的測定─碘量法

參考GB/T 5009.37—2003《動(dòng)植物油脂過氧化值測定》的國家標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 貨架壽命預(yù)測

由范德霍夫規(guī)則[17]可知，化學(xué)反應(yīng)速率受溫度影響，且溫度每升高10 ℃，反應(yīng)速率提高2～4倍，即K(T+10)/K(T)=γ(2～4)，而食品貨架壽命(S)與反應(yīng)速率常數(shù)K成反比，即K越大，貨架壽命越小，S(T)/S(T+10)=γ(2～4)，由γ=2可得出表1的相關(guān)數(shù)據(jù)。

表1 溫度與貨架壽命系數(shù)關(guān)系

由表1可知，采用Schaal烘箱法在60 ℃實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)1 d相當(dāng)于20 ℃下貯藏的16 d，據(jù)此可預(yù)測牡丹籽油的保存時(shí)間。

1.3.6 單一抗氧化劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，按照各抗氧化劑的0.02%添加量，準(zhǔn)確稱取各抗氧化劑：水溶性迷迭香提取物、脂溶性迷迭香提取物、野葡萄籽多酚、葡萄多酚、牡丹籽多酚、茶多酚、蘋果多酚、BHT、BHA、TBHQ和生育酚等于樣品瓶中，然后在各個(gè)瓶中加入少量無水乙醇溶解抗氧化劑，接著加入63 mL牡丹籽油，超聲，使抗氧化劑均勻地分散于油脂中。以未添加抗氧化劑的等量油樣做空白對照，置于60 ℃精密恒溫培養(yǎng)箱中保存。定期測定油樣的POV值，每次測量前充分搖勻油樣，測量后交換樣品在培養(yǎng)箱中的位置。比較在相同添加濃度下，不同天然抗氧化劑在牡丹籽油中的抗氧化效果。

在對式(3)進(jìn)行OLS估計(jì)時(shí)，如果序列是非平穩(wěn)的，則可能導(dǎo)致“偽回歸”。Engle和Granger (1987)提出的單方程線性協(xié)整模型較好地解決了這一問題，其形式如下：

將本步驟中的不同抗氧化劑分別加入0.02%維生素C和0.02%檸檬酸，其他處理步驟同上，考察增效劑對抗氧化劑作用效果的影響。

1.3.7 復(fù)合天然抗氧化劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，復(fù)合抗氧化劑的抗氧化效果一般較單一抗氧化劑要好[19-20]。為了進(jìn)一步提高抗氧化劑對牡丹籽油的抗氧化能力，將抗氧化作用效果較好的天然抗氧化劑：葡萄多酚、牡丹籽多酚、茶多酚、蘋果多酚、生育酚、脂溶性迷迭香等分別兩兩復(fù)合后添加到牡丹籽油中，研究抗氧化劑復(fù)合后對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響。復(fù)合抗氧化劑的添加總量為牡丹籽油質(zhì)量的0.02%(每個(gè)復(fù)合抗氧化劑的添加量均為0.01%)，按照步驟1.3.6操作進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

在本步驟中的不同復(fù)合天然抗氧化劑再分別加入0.02%維生素C和0.02%檸檬酸，其他處理步驟同上，考察增效劑對復(fù)合抗氧化劑作用效果的影響。

1.3.8 天然抗氧化劑與合成抗氧化劑復(fù)合對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響

在合成抗氧化劑TBHQ中加入對牡丹籽油抗氧化作用效果較好的天然抗氧化劑：葡萄多酚、牡丹籽多酚、茶多酚、蘋果多酚、生育酚、脂溶性迷迭香等，考察TBHQ復(fù)合天然抗氧化劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的的影響。復(fù)合抗氧化劑的總用量控制在牡丹籽油質(zhì)量的0.02%左右(TBHQ和天然抗氧化劑含量均為0.01%)，按照步驟1.3.6操作進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，曲線的回歸方程為：

Y=0.093 09X+0.005 34，R2= 0.999 4

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

方程表明，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.05～3.5 μg/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。不同類型的天然抗氧化劑的多酚含量測試結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同類型的天然抗氧化劑多酚含量

由圖2所示，不同類型的天然抗氧化劑中多酚類化合物的含量不同，其中茶多酚含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.79%，其次為蘋果多酚和葡萄多酚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為65.36%和57.87%。含量較低的為脂溶性迷迭香和水溶性迷迭香，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.69%和23.76%。由圖2可以看出，不同天然抗氧化劑中多酚類化合物的含量不同。

2.2 單一天然抗氧化劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響

由圖3可以看出，所有油樣的過氧化值均隨著貯藏時(shí)間的增加而增大，也就是說貯藏時(shí)間越長，牡丹籽油的氧化酸敗程度越大。添加抗氧化劑后，牡丹籽油樣品的POV值明顯低于空白對照組，說明氧化劑的加入可以有效延緩牡丹籽油的氧化酸敗。

圖3 單一抗氧化劑對牡丹籽油抗氧化效果影響

幾種抗氧化劑對牡丹籽油抗氧化作用效果依次為：TBHQ>脂溶性迷迭香提取物>茶多酚>葡萄多酚>蘋果多酚>牡丹籽多酚>BHT>水溶性迷迭香提取物>野葡萄多酚>BHA>VE。研究發(fā)現(xiàn)，幾種天然抗氧化劑在牡丹籽油中的抗氧化活性作用均弱于常用的油脂抗氧化劑TBHQ，其中脂溶性迷迭香提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制牡丹籽油的氧化作用，其作用效果與合成抗氧化劑TBHQ接近，強(qiáng)于合成抗氧化劑BHA和BHT的作用效果，與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[21]。另外，茶多酚，葡萄多酚，蘋果多酚，牡丹籽多酚均表現(xiàn)出較好的抑制牡丹籽油氧化作用效果，抗氧化作用效果均強(qiáng)于合成抗氧化劑BHA和BHT。結(jié)合圖2中不同抗氧化劑多酚含量的測定結(jié)果，可以看出茶多酚，葡萄多酚，蘋果多酚，牡丹籽多酚等在牡丹籽油中的抗氧化作用效果與其多酚含量有非常密切的關(guān)系，多酚含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)。這也說明了這幾種抗氧化劑中多酚類化合物是其具有較好抗氧化作用的主要活性物質(zhì)。迷迭香中除了含有多酚類化合物外，還含有多種有機(jī)酸和萜類等活性成分[22]，因此盡管迷迭香中多酚含量并不高，但卻表現(xiàn)出較好的抗氧化作用。脂溶性迷迭香對牡丹籽油的抗氧化作用強(qiáng)于水溶性迷迭香，可能是由于水溶性迷迭香在牡丹籽油中的溶解性相對較小，從而導(dǎo)致抗氧化活性作用降低。野葡萄籽提取物在牡丹籽油中的抗氧化作用相對較弱，可能與其提取物中較低的多酚含量有關(guān)。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加了VE后，牡丹籽油的POV值高于空白對照組的POV值，這說明VE在本實(shí)驗(yàn)中對牡丹籽油的氧化酸敗有一定的促進(jìn)作用，可能是由于牡丹籽油中含有一定量的VE，VE的加入使牡丹籽油中的VE含量過高所致。所以在選擇VE作為牡丹籽油的抗氧化劑時(shí)，一定要注意加入量，過量的VE對油脂的氧化具有一定的促進(jìn)作用，會(huì)影響抗氧化作用效果[17,23]。

2.3 天然抗氧化劑加增效劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響

增效劑維生素C和檸檬酸對天然抗氧化劑抗氧化作用效果影響見圖4所示。從圖4可以看出，添加了增效劑維生素C和檸檬酸后，各抗氧化劑在牡丹籽油中的抗氧化活性作用效果均有提高。說明增效劑對天然抗氧化劑和合成抗氧化劑均可以起到較好的增效作用。增效劑對抗氧劑的作用效果并不完全相同，其中維生素C的增效效果要強(qiáng)于檸檬酸，這可能與檸檬酸和維生素C不同的協(xié)同抗氧化作用途徑有關(guān)。檸檬酸和維生素C均可以螯合油脂中的金屬離子，通過使金屬離子鈍化來達(dá)到抑制油脂氧化的目的。另外，檸檬酸還可以通過使酚類抗氧化劑氧原子上不成對的單電子與苯環(huán)上的π電子云發(fā)生共軛作用，使不成對單電子分散到苯環(huán)上，從而降低了體系自由基的能量，形成相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，油脂氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中斷，從而提高了抗氧化能力[11]。而維生素C本身就是抗氧化劑，可以通過捕獲油脂氧化過程中產(chǎn)生的自由基和降低油脂中活性氧的濃度來阻斷油脂氧化的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[24]。

圖4 添加增效劑對牡丹籽油抗氧化效果影響

2.4 復(fù)合抗氧化劑對牡丹籽油氧化穩(wěn)定性的影響

不同類型的抗氧化劑復(fù)合后對牡丹籽油抗氧化作用效果見圖5所示。由圖5可以看出，添加了復(fù)合抗氧化劑后，牡丹籽油的氧化穩(wěn)定性明顯提高，復(fù)合后抗氧化劑發(fā)揮了較好的抗氧化作用效果。添加了0.01%脂溶性迷迭香+0.01%葡萄籽多酚和0.01%脂溶性迷迭香+0.01%茶多酚的牡丹籽油的過氧化值最小，表明脂溶性迷迭香與葡萄籽多酚和茶多酚的復(fù)合作用效果最好，明顯強(qiáng)于其他各組的復(fù)合效果，且復(fù)合后抗氧化作用效果與合成抗氧化劑TBHQ相當(dāng)。同樣，與脂溶性迷迭香復(fù)合后，牡丹籽多酚的抗氧化作用效果也明顯增強(qiáng)。

圖5 復(fù)合天然抗氧化劑對牡丹籽油抗氧化效果影響

抗氧化劑復(fù)合后的協(xié)同作用可能與不同類型的抗氧化活性物質(zhì)的抗氧化作用機(jī)制有關(guān)[25]。本研究采用的幾種天然抗氧化劑中主要活性成分差異較大，脂溶性迷迭香的抗氧化活性物質(zhì)是以鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酚等為代表的二萜酚酸和以迷迭香酸為代表的羥基苯丙酸類化合物[22]；葡萄籽多酚由酚酸類、兒茶素類、花色苷類、黃酮醇類和縮聚單寧等物質(zhì)組成，其中以花色苷的含量最為豐富，可以達(dá)到80%～85%，其他成分如兒茶素和表兒茶素的含量次之，大約為5%[26]；茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包括兒茶素類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，主要為兒茶素類，占60%～80%[27]；牡丹籽多酚主要為低聚茋類化合物[15-16]。不同類型的活性成分可能有不同的抗氧化作用機(jī)制，復(fù)合后會(huì)產(chǎn)生一定的協(xié)同抗氧化作用效果[28-29]。

圖6 復(fù)合天然抗氧化劑添加增效劑后對牡丹籽油抗氧化效果影響

同時(shí)，從圖6可以看出，增效劑的加入同樣可以起到增強(qiáng)復(fù)合抗氧化劑的抗氧化作用效果的目的。

2.5 天然抗氧化劑對合成抗氧化劑TBHQ的增效作用

脂溶性迷迭香提取物、茶多酚、葡萄多酚、蘋果多酚和牡丹籽多酚等5種天然抗氧化劑對合成抗氧化劑TBHQ的協(xié)同及增效作用結(jié)果見圖7所示。

圖7 復(fù)合天然抗氧化劑與TBHQ后對牡丹籽油抗氧化效果影響

從圖7可以看出，天然抗氧化劑添加到TBHQ中后，在牡丹籽油中的抗氧化活性均大于添加量為0.01%的TBHQ的抗氧化活性作用，表現(xiàn)出較好的增效作用。表明天然抗氧化劑對合成抗氧化劑也具有較好的協(xié)同增效作用。因此，在應(yīng)用合成抗氧化劑的時(shí)候可以適當(dāng)添加一些具有協(xié)同作用的天然抗氧化劑，這樣不僅可以降低合成抗氧化劑的用量，減少合成抗氧化劑由于潛在毒性和副作用等缺陷帶來的食品安全問題，還可以更好發(fā)揮天然抗氧化劑的保健優(yōu)勢[12]。

2.6 牡丹籽油貨架壽命的預(yù)測

國標(biāo)規(guī)定，食用植物油脂POV值應(yīng)該小于或等于6 mmol/kg。表2數(shù)據(jù)給出牡丹籽油在60 ℃條件下的儲藏時(shí)間，由此即可預(yù)測出牡丹籽油在20 ℃條件下的保存時(shí)間，其結(jié)果如圖8所示。

表2 60 ℃牡丹籽油的儲藏實(shí)驗(yàn)

注：橫坐標(biāo)序號代表的抗氧化劑與表2對應(yīng)一致。圖8 抗氧化劑與牡丹籽油儲存時(shí)間的關(guān)系

由圖8可知，未添加抗氧化劑的牡丹籽油，60 ℃加速氧化條件下的儲存期為2.5 d，而添加FSR+TP+VC和FSR+TP+CA實(shí)驗(yàn)組的儲存期分別為6.51 d和6.45 d，添加這兩種復(fù)合抗氧化劑可使牡丹籽油在20 ℃條件下的貨架壽命從40 d延至超過103 d，抗氧化作用效果與TBHQ非常接近。

3 結(jié)論

在國家允許添加量范圍內(nèi)，幾種天然多酚抗氧化劑均能提高牡丹籽油的氧化穩(wěn)定性，但單獨(dú)使用的效果要弱于人工合成抗氧化劑。維生素C與檸檬酸是抗氧化劑的良好增效劑，協(xié)同抗氧化作用顯著，且維生素C的效果優(yōu)于檸檬酸。在牡丹籽油體系中，脂溶性迷迭香提取物抗氧化效果較為理想，與合成抗氧化劑TBHQ效果接近。復(fù)合抗氧化劑的抗氧化效果優(yōu)于同等質(zhì)量濃度的單一抗氧化劑，復(fù)合添加0.01%茶多酚+0.01%脂溶性迷迭香+0.02%維生素C、0.01%蘋果多酚+0.01%牡丹籽多酚+0.02%VC和0.01%茶多酚+0.01%脂溶性迷迭香+0.02%檸檬酸均能顯著減緩牡丹籽油的氧化速度，使牡丹籽油的貯藏時(shí)間明顯延長。