姚軼俊 袁 強 鞠興榮 王立峰

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(江南大學食品學院2，無錫 214122)

近20年來，隨著經(jīng)濟的快速增長和工業(yè)化的發(fā)展，老齡化，空氣污染，和生活方式的改變已經(jīng)使中國疾病譜發(fā)生了改變。癌癥是全世界人類死亡和疾病的主要原因。大多數(shù)癌癥的痊愈率低，治療費用高，因此癌癥給病人帶來了巨大的經(jīng)濟負擔，并對他們的生活造成了負面影響[1]。癌癥是由于環(huán)境因素的累積或基因遺傳，促使正常細胞不斷生長分裂導致無限增殖，最終發(fā)展成為腫瘤；腫瘤細胞會逐漸擴散到周圍組織，如果不及時治療，最終會通過淋巴系統(tǒng)和血液擴散到人體各個器官和組織[2]。癌細胞和正常細胞之間的主要區(qū)別是，前者失去所謂的自毀信號，生長和增殖無限而且雜亂無章[3]。所以加快對抗腫瘤機制研究，找到抑制腫瘤細胞無限增殖的手段，從而為臨床醫(yī)學中抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)顯得尤為重要[4]。目前的癌癥治療方案中，以肽作為藥物引起了人們的廣泛關注。多肽擁有一定的關鍵優(yōu)勢來替代化療分子，例如對于大多數(shù)小分子藥物，多肽有很好的親和力，目標特異性強，毒性低[5]。動植物作為潛在抗癌藥來源已經(jīng)被廣泛的研究，可以通過降解或加工形成更小分子質(zhì)量、具有天然穩(wěn)態(tài)機制的蛋白肽[6-7]。王竹君等[8]通過雙酶水解螺旋藻蛋白，經(jīng)超濾，凝膠色譜分離得到D1組分，通過分析該組分的氨基酸序列為 AGGASLLLLR，對HepG-2有顯著的抑制作用。Siri等[9]發(fā)現(xiàn)重組rtEa4肽通過基質(zhì)膠膜抑制人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的生長，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性，細胞內(nèi)的uPA，tPA，PAL1等基因的表達受到了顯著性的抑制。伍強等人以紅毛藻為原料提取R-藻紅蛋白，并通過胃蛋白酶和胰蛋白酶水解R-藻紅蛋白，分離純化出活性肽ALLAGDPSVLEDR，研究發(fā)現(xiàn)對癌細胞(HepG2、SMMC 7721、Caco-2)增殖具有抑制作用[10]。

菜籽蛋白水解物具有較高的生物活性，具有調(diào)節(jié)生理功能的作用，如降血壓，抗氧化，增強免疫調(diào)節(jié)，降膽固醇及抑制腫瘤活性[11-13]，有著很好的發(fā)掘潛力和廣闊的應用市場。因此，本實驗通過超濾，葡聚糖凝膠柱和半制備液相對菜籽蛋白水解物進行分離純化，并采用MTT法對各級組分進行分析測定，研究了各組分對結腸癌細胞Caco-2、肝癌細胞HepG2、乳腺癌細胞MBA-MD-231的生長抑制作用，并通過分析各組分對癌細胞抑制率影響的差異性確定了抗腫瘤的主要組分，為后續(xù)進一步研究菜籽抗腫瘤分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧雜19號油菜籽；Sephadex G-15凝膠填料；堿性蛋白酶、風味蛋白酶、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)；乙腈、三氟乙酸Merck公司；噻唑藍( MTT)、二甲基亞砜( DMSO)；人體肝癌細胞株HepG2、結腸癌細胞株Caco-2、乳腺癌細胞株MBA-MD-231；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)。

1.2 儀器與設備

E-812索氏抽提裝置；QL-861漩渦振蕩器；SpectraMax M2e多功能酶標儀；HERACELL150i-CO2培養(yǎng)箱；25 cm2密封蓋培養(yǎng)瓶；SX-500快速自動高壓滅菌鍋；ALpHA2-4冷凍干燥機；THZ-D臺式恒溫振蕩器；膜分離裝置；HD-3紫外檢測儀；HL-2恒流泵；XWT-S小型臺式記錄儀；BSZ-100自動收集器；PHS-3C雷磁pH計；RE52CS旋轉蒸發(fā)儀；HH-6恒溫水浴鍋；XD30A倒置式生物顯微鏡；HERACELL 150i-CO2培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 菜籽蛋白的制備

將油菜籽脫殼，用索氏抽提脫油，置于通風櫥晾干，然后粉碎過篩。將制得的菜籽粉按1/20的質(zhì)量比充分溶解于去離子水中，然后調(diào)節(jié)溶液的pH至11.0，在室溫下勻速攪拌1 h，然后低速離心(5 000 g，30 min)，收集上清液并調(diào)節(jié)pH為4.5，靜置1h后棄掉上清液，用無水乙醇洗滌沉淀2～3次，冷凍干燥即得到菜籽蛋白。

1.3.2 菜籽蛋白水解物的制備

取12.5 g菜籽蛋白，用去離子水溶解后配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，將溶液pH調(diào)至9.0，并加入6 000 U/g的堿性蛋白酶，于55 ℃水浴中酶解3 h后加入4 000 U/g的風味蛋白酶繼續(xù)于55 ℃水浴中酶解2 h。水浴過程中用1 mol/L的NaOH保持pH值恒定，反應結束后煮沸15 min滅酶，冷卻后調(diào)節(jié)pH至7，于50 ℃水浴中酶解2 h，水浴過程中用1 mol/L的HCl保持pH值恒定，反應結束后煮沸15 min滅酶，冷卻后離心(10 000 g，30 min,4 ℃)，收集上清液，過0.45 μm微濾膜后冷凍干燥得到菜籽蛋白水解物(RPHs)。

1.3.3 菜籽蛋白水解物的超濾膜分離

將菜籽蛋白水解物(RPHs)溶于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，通過截留分子質(zhì)量為1 ku的超濾膜，超濾過程控制壓力在0.10～0.5 MPa之間，分別收集0～3 ku分子質(zhì)量段的菜籽肽液，然后經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥，稱量所得該分子質(zhì)量段凍干粉的質(zhì)量。

1.3.4 葡聚糖凝膠柱Sephadex G-15分離純化

在室溫下，將葡聚糖凝膠粉末在去離子水中浸泡至少24 h，并用玻璃棒不斷攪拌以保證凝膠溶脹，直至凝膠充分溶脹，凝膠體積不再變化；根據(jù)填料柱的要求，將溶脹的凝膠同時放入柱中，應注意保持柱子濕潤，避免裝柱中出現(xiàn)氣泡或出現(xiàn)分層；上樣前使用至少3-5個柱體積的去離子水平衡凝膠柱，直到記錄儀的基線穩(wěn)定。

上樣過程參考了張晶等葡聚糖凝膠G-15柱分離純化的方法[14]。取8g經(jīng)超濾膜分離的菜籽蛋白肽組分(配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，并過0.22 μm的濾膜；樣品溶液分多次上樣洗脫，每次上樣約5 mL，洗脫液采用去離子水，恒流泵的流速設置為18 mL/h，紫外吸收波長設置為280 nm，用自動收集器每10 min收集一管餾分，合并具有相同最大吸收峰的餾分，將所得餾分進行旋轉蒸發(fā)、冷凍干燥，從而得到葡聚糖凝膠色譜柱分離純化的組分。為了保證分離組分的一致性，凝膠柱在使用10次后作一次清洗，除去凝膠柱中殘留的沉淀和一些頑固的蛋白質(zhì)；方法是用濃度為1 mol/L氫氧化鈉，流速為40 mL/h，反向洗脫凝膠柱3～4個柱體積，再用去離子水正向沖凝膠柱3～4個柱體積再生。

1.3.5 半制備型RP-HPLC分離純化

參照文獻[15]，并做一定修改。采用半制備型RP-HPLC對經(jīng)2.2.3分離得到的功能活性最高的組分進一步分離純化。將樣品配制成0.1 mg/mL溶液后采用0.22 μm一次性過濾器過濾。色譜柱采用XBridgeTM C18 (10 mm×150 mm, 5 μm)，進樣體積為100 μL，液相洗脫條件如表1，其中流動相A：100%超純水(含0.1 %三氟乙酸)，流動相B：100%乙腈(含0.1 %三氟乙酸)，柱溫箱溫度30 ℃，洗脫流速2.46 mL/min，檢測波長215 nm，收集主要洗脫峰，真空濃縮并冷凍干燥后檢測各組分的功能活性。色譜圖采用系統(tǒng)自帶的Empower 2(Water，USA)積分軟件處理。

表1 半制備液相RP-HPLC洗脫條件

1.3.6 細胞培養(yǎng)

人體肝癌細胞HepG2、人體結腸癌細胞Caco-2和人體乳腺癌細胞MBA-MD-231，用含有 10%胎牛血清 (FBS)，0.1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，隔天換液，使用顯微鏡觀察細胞在培養(yǎng)瓶底部的生長情況，待細胞在瓶底長滿后，加入1.5 mL 0.25%的胰酶，放置在培養(yǎng)箱中消化3 min，待細胞脫落后，用移液槍將細胞懸浮液轉移到離心管中離心3 min(1 000 r/min，4 ℃)，然后吸取1 mL培養(yǎng)液加入到離心管中緩慢吹打20次左右，使細胞密度均勻，按照1∶2或1∶3進行傳代。

1.3.7 抗腫瘤活性分析

收集對數(shù)生長期的HepG2細胞、Caco-2細胞及MBA-MD-231細胞，通過細胞計數(shù)板計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞密度至1×105個/mL，將細胞懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸浮液，同時設置空白組(只加入100 μL不含細胞的培養(yǎng)液，不加細胞和樣品)；將96孔板置于37 ℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后吸棄培養(yǎng)液，并向每孔中加入100 μL用DMEM稀釋的不同質(zhì)量濃度(50，100，200，300，400，500，1 000 μg/mL)的待測樣品，每個濃度均設6個重復，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育24 h，24 h后在各孔中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃下于恒溫振蕩器上振蕩30 min，待結晶全部溶解后，置于570 nm下測定OD值。細胞存活率和細胞抑制率參照張子棟等[16]的方法分別按式(1)、式(2)計算：

(1)

細胞抑制率=

(2)

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復測定3次，結果表示為平均值±標準差(SD)。所有的圖形用Graphpad prism 6作圖。

2 結果與分析

2.1 菜籽蛋白水解物的超濾分析

2.1.1 超濾膜分離組分得率

由表2可知，通過超濾分離技術將菜籽蛋白水解物分離得到了分子質(zhì)量小于1 ku的組分，該組分(RPHs)占菜籽蛋白水解物的比例為51.8%，這表明大部分的菜籽蛋白被堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解成低分子質(zhì)量的可回收的菜籽多肽。同時，分子質(zhì)量<3 ku的菜籽多肽約占總水解物的71.58%，此結果與Girgih等[17]的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)亞麻籽肽經(jīng)超濾膜分離后，其中小于3 ku的組分得率是其他各組分得率的3 倍。

表2 RPHs超濾膜分離組分得率

2.1.2 超濾膜分離組分的抗腫瘤活性分析

菜籽蛋白水解物經(jīng)超濾膜分離后，選取三種腫瘤細胞(人體肝癌細胞株HepG2、結腸癌細胞株Caco-2、乳腺癌細胞株MBA-MD-231)對其進行體外抗增殖活性分析，實驗結果如圖1所示，在質(zhì)量濃度為50～1 000 μg/mL的劑量范圍內(nèi)，RPHs對HepG2細胞、MBA-MD-231細胞及Caco-2細胞均有一定的抑制作用，且抑制效果與樣品濃度之間呈現(xiàn)出一定的劑量關系。其中，1 000 μg/mL樣品作HepG2細胞24 h，抑制率達到(30.66±3.53)%，高于MBA-MD-231細胞(21.34±2.67)%及Caco-2細胞(15.03±1.78)%，研究表明HepG2細胞對RPHs的作用最敏感，所以在接下來的試驗中選取HepG2細胞來分析菜籽蛋白水解物的抗腫瘤活性。

a

b

圖1 不同濃度的RPHs對3種腫瘤細胞活力和抑制率的影響

2.2 菜籽蛋白水解物的凝膠色譜分析

2.2.1 Sephadex G-15凝膠色譜分離

經(jīng)過超濾膜分離的組分RPHs進一步通過葡聚糖凝膠色譜柱(Sephadex G-15)進行洗脫分離，得到了2個洗脫峰，以洗脫時間為X軸，以紫外檢測的 OD值為Y軸作圖，結果如圖2所示；收集這2個主要的峰，并分別命名為RPHs-F1和RPHs-F2。根據(jù)葡聚糖凝膠柱分離的工作原理可知，RPHs-F2的分子質(zhì)量小于RPHs-F1。收集各組分的洗脫液，旋轉蒸發(fā)，冷凍干燥，儲存于-20 ℃下待用。

圖2 Sephadex G-15分離純化RPHs的柱層析圖

2.2.2 凝膠色譜分離組分的抗腫瘤活性分析

以HepG2細胞為研究對象，采用MTT比色法對葡聚糖凝膠色譜柱分離所得的組分進行體外抗增殖活性的分析。由圖3可知，兩種組分RPHs-F1、RPHs-F2不同濃度給藥處理HepG2細胞24 h，在質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，抑制率分別為(18.34±2.44)%，(35.58±2.90)%，說明組分RPHs-F2的抗腫瘤活性優(yōu)于組分RPHs-F1，并且與分離前組分(抑制率30.66%)相比，抗腫瘤活性有了一定程度的提升；因此，經(jīng)葡聚糖凝膠色譜柱純化的RPHs(MW<1 ku)具有更高的抗腫瘤活性。

a

b

圖3 不同濃度的凝膠色譜分離組分對HepG2細胞活力和抑制率的影響

2.3 菜籽蛋白水解物的半制備型RP-HPLC分析

2.3.1 半制備型RP-HPLC分離純化

利用半制備液相RP-HPLC對經(jīng)超濾膜分離及葡聚糖凝膠柱Sephadex G-15柱層析獲得的具有較高活性的功能菜籽肽組分(RPHs-F2)進行進一步的分離純化，如圖4所示，得到4個主要組分，按照出峰順序依次命名為RPHs-F2-1、RPHs-F2-2、RPHs-F2-3及RPHs-F2-4，以HepG2細胞為模型分別測定了這4個組分的體外抗增殖活性。

圖4 半制備RP-HPLC分離純化RPHs-F2 的液相色譜圖

2.3.2 半制備RP-HPLC分離組分的抗腫瘤活性分析

半制備RP-HPLC能根據(jù)多肽分子質(zhì)量大小、結構等分理處單一組分的肽，對低分子質(zhì)量肽具有較高的分辨率及純化度，是目前分離、純化多肽的主要方法之一。分子質(zhì)量較低的RPHs-F2經(jīng)半制備液相分離后得到4種組分，分別對4種進行體外抗增殖活性分析，結果如圖5所示，組分RPHs-F2-4對HepG2細胞的體外增殖幾乎沒有抑制作用(在質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，對HepG2細胞的抑制率為11.53%)；其余3個組分的抑制作用則相對明顯，且與作用濃度之間呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；在各組分樣品質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，組分RPHs-F2-1，RPHs-F2-2，RPHs-F2-3對HepG2細胞體外增殖的抑制率分別為(28.58±2.93)%，(21.23±4.07)%，(51.53±5.59)%；結果表明，菜籽肽組分RPHs-F2-3顯示出更強的抗腫瘤活性。通過與相關文獻中菜籽蛋白水解物各組分的抗炎活性對比，發(fā)現(xiàn)菜籽蛋白組分的抗腫瘤活性與菜籽抗炎肽的呈現(xiàn)出一定的相關性，來路皓等[18]通過合成γ-炔酸酯類化合物，并檢測此種化合物的抗炎和抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其是一種雙重抑制劑，表現(xiàn)出抗炎和抗腫瘤的雙重活性；劉仁杰等[19-21]利用縮合和環(huán)化手段合成異長葉烷基喹唑啉類衍生物3a～3f，通過MTT法對合成所得化合物進行了人體肝癌細胞抗腫瘤活性

圖5 不同濃度的半制備液相分離組分對HepG2細胞活力和抑制率的影響

測定，以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞抗炎活性測定，研究發(fā)現(xiàn)化合物3f既有較強抗腫瘤的活性也有一定的抗炎活性，因此可以預測抑制炎癥發(fā)生信號通路和與抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路可能有相同的關鍵因子。其中抗腫瘤活性的具體抑制機制，需要后續(xù)進一步通過實驗研究分析。

3 結論

本實驗將脫殼、脫油后的菜籽餅粕通過堿提酸沉的方法制備得到菜籽蛋白，進一步通過分步酶解(堿性蛋白酶-風味蛋白酶)制備菜籽蛋白水解物；在經(jīng)過超濾、葡聚糖凝膠柱(Sephadex G-15)以及半制備液相RP-HPLC等一系列分離純化手段，采用MTT比色法分析RPHs(MW<1 ku)對人體HepG2肝癌細胞、乳腺癌細胞MBA-MD-231及人體結腸癌細胞Caco-2的體外抗增殖活性，篩選出敏感細胞株；進一步測定各組分對敏感細胞株HepG2細胞的體外增殖抑制作用。

實驗結果發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為50～1 000 μg/mL的劑量范圍內(nèi)，RPHs對HepG2細胞、MBA-MD-231細胞及Caco-2細胞均有一定的抑制作用，且抑制效果與樣品濃度之間呈現(xiàn)出一定的劑量關系。對同一種細胞而言，樣品濃度越高，抑制效果越顯著；其中，HepG2細胞對RPHs的作用最為敏感；所以在接下來的試驗中選取HepG2細胞來分析菜籽蛋白水解物的抗腫瘤活性。對葡聚糖凝膠色譜柱分離所得的組分進行體外抗增殖活性的分析，兩種組分RPHs-F1、RPHs-F2在質(zhì)量質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，對HepG2細胞抑制率分別為(35.58±2.90)%，(18.34±2.44)%，說明組分RPHs-F2的抗腫瘤活性優(yōu)于組分RPHs-F1，并且與分離前組分(抑制率30.66%)相比，抗腫瘤活性有一定的增強。組分RPHs-F2-4對HepG2細胞的體外增殖幾乎沒有抑制作用；其余3個組分的抑制作用則相對明顯，且與作用濃度之間呈現(xiàn)一定劑量依賴性；在樣品質(zhì)量質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，組分RPHs-F2-3對HepG2細胞體外增殖的抑制率最高，為(51.53±5.59)%，所以菜籽肽組分RPHs-F2-3具有更強的抗腫瘤活性。