龍柳艷 韋曉謀

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院 健康管理部體檢科 廣西 柳州 545005）

多瘤病毒是一類可以感染人類的、無囊膜的正二十面體小DNA病毒[1]，主要包括猴多瘤病毒（SV40）、人多瘤病毒（BKV）和JC病毒（JCV）等3種病毒[2]。多瘤病毒呈全球性分布，在人群中廣泛傳播[3]。我院研究室調(diào)查研究顯示BKV在廣西瑤、侗、苗、壯等少數(shù)民族外周血白細(xì)胞中存在較高感染率[4]。為了進(jìn)一步了解多廇病毒SV40、BKV及JCV在健康人群血液標(biāo)本中的感染率情況，我們收集了1000例健康成人的血液標(biāo)本，用巢式PCR方法擴(kuò)增多瘤病毒的保守區(qū)編碼序列，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取到我院參加健康體檢的健康成人1000例，男女各半，年齡不限，收集上述研究對象靜脈血3ml存于EDTA抗凝管。

1.2 儀器設(shè)備材料

設(shè)備：DNA核酸分析儀、DNA電泳儀、Pe5700-PCR儀、日立低溫高速離心機(jī)、日立低濕超速離心機(jī)旋渦混旋器、及凝膠成像系統(tǒng)等分子生物學(xué)儀器，BKV-DNA、SV40-DNA、及JCV-DNA定性試劑。

1.3 操作方法

1.3.1 具體操作過程 隨機(jī)選取到我院參加健康體檢的健康人員1000例，男女各半，年齡不限。收集受試者空腹肝素抗凝靜脈血3ml，尿液10ml。分離PBLs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為105/ml濃度，200μl/管分裝，提取基因組DNA。

PCR反應(yīng)檢測SV40基因：上游引物5`-GCGTGACAGCCGGCGCAG CACCA-3`，下游引物5`-GTCCATTAGCTGCAAAGATTCCTC-3`（由上海申能博彩合成），反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環(huán)，72℃7min，擴(kuò)增目的片段為487bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，（陽性質(zhì)控標(biāo)本購自解放軍總院），50bp DNA Ladder購自申能博彩。

PCR反應(yīng)檢測BKV基因：PCR擴(kuò)增BKV－DNA序列，2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR結(jié)果，第一次PCR擴(kuò)增：得到176bp DNA產(chǎn)物，第二次PCR擴(kuò)增：得到149bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

PCR反應(yīng)檢測JCV基因：上游引物5`-CCCCATACCAACTTAGC TTTC-3`，下游引物5`-CCAATTTGTAAGGCAGATAG-3`（由上海申能博彩合成），反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環(huán)，72℃7min，擴(kuò)增目的片段為251bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3.2 觀察指標(biāo)及方法 觀察指標(biāo)：在瓊脂糖凝膠電泳中，在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)特異性片段為陽性，無特異性片段為陰性。

觀察方法：全部PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測是否有特異性片段產(chǎn)物產(chǎn)生。

1.3.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用PCR擴(kuò)增樣本中的多瘤病毒DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)特異性片段為陽性，無特異性片段為陰性（參見《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版）。通過檢測健康成人血標(biāo)本中多瘤病毒SV40、BKV及JCV的DNA，檢測其陽性率；并統(tǒng)計(jì)分析不同性別、不同年齡組健康成人血標(biāo)本多瘤病毒SV40、BKV及JCV的檢出率及其差別有無顯著性區(qū)別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用PENS3.1軟件系統(tǒng)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

健康成人血標(biāo)本中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率較高，分別是：23.5%、57.2%、32.1%。不同性別組、不同年齡組差異無顯著性意義（P＞0.05），見表1、表2。

表1 不同性別多瘤病毒的感染率[n（%）]

表2 不同年齡多瘤病毒的感染率[n（%）]

3.討論

多瘤病毒是正常細(xì)胞異常增殖、分化的一類DNA病毒，因其能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生腫瘤而得名，當(dāng)人體檢免疫功能低下，HIV感染者或移植等患者中，多瘤病毒可再度激活，引起相關(guān)疾病。如HIV患者合并JCV相關(guān)的進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病（PML）；腎移植后病人并發(fā)BKV相關(guān)性腎?。˙KVN）等等，目前研究認(rèn)為多瘤病毒感染和人類多種疾病相關(guān)：出血性膀胱炎、間質(zhì)性腎小球腎炎、輸尿管狹窄、血管病變、肺炎、腦炎、視網(wǎng)膜炎甚至多器官功能衰竭。

多瘤病毒的傳播途徑尚未完全闡明，目前國內(nèi)在不同地域和不同人群中多瘤病毒感染的發(fā)生率的研究報(bào)道也較少。正常人群原發(fā)性多瘤病毒感染常發(fā)生于幼年時，常常無明顯的臨床癥狀，病毒不能完全被機(jī)體的免疫系統(tǒng)排除，而潛伏在腎組織和PBLs中。但多瘤病毒抗體對多瘤病毒再次激活并無明顯抵抗作用，當(dāng)HIV感染者和病人免疫功能下降時，尤其是T細(xì)胞功能低下的患者中感染的多瘤病毒可反復(fù)激活，其子代病毒開始大量復(fù)制，導(dǎo)致腎功能減退乃至腎功能喪失、進(jìn)行性腦白質(zhì)病（PML）等各種嚴(yán)重病發(fā)癥。

為研究多瘤病毒SV40、BKV、JCV在健康人群中的感染率，課題研究組在我院體檢中心隨機(jī)選擇1000例健康受檢人員EDTA抗凝靜脈血3ml在我院檢驗(yàn)科PCR實(shí)驗(yàn)室由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行PCR檢測比較。結(jié)果提示：多瘤病毒SV40、BKV及JCV在柳州地區(qū)健康人群中存在較高的感染率，證實(shí)了PBLs是多瘤病毒在體內(nèi)的潛伏細(xì)胞及傳播載體，應(yīng)加強(qiáng)對多瘤病毒條件致病性的認(rèn)識，積極防治、減少多瘤病毒相關(guān)性疾病的發(fā)生率。