凌夢(mèng)娟，王一飛，貢 嘎，董海龍，田發(fā)益，吳慶俠*

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 臨床獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 林芝 860000）

藏雞是我國(guó)青藏高原的地方雞種，主要分布于我國(guó)青藏高原海拔2 200～ 4 100 m的半農(nóng)半牧區(qū)、雅魯藏布江中游流域河谷區(qū)和藏東三江中游高山峽谷區(qū)。該雞體型輕小，胸腿肌肉發(fā)達(dá)，活潑好動(dòng)，覓食能力強(qiáng)，極耐粗放，對(duì)高海拔地區(qū)的高寒惡劣氣候條件有良好的適應(yīng)能力，是發(fā)展我國(guó)高海拔地區(qū)養(yǎng)雞業(yè)的重要品種資源[1-2]。

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的A類傳染病中，禽類烈性傳染病只有兩種，分別是禽流感和新城疫[3]，禽流感又叫真性雞瘟或者歐洲雞瘟，是一種由A型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽類的一種急性、高度致死性傳染病，以急性敗血性死亡到無(wú)癥狀帶毒為特征，主要對(duì)雞的泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生影響，是現(xiàn)階段嚴(yán)重威脅雞健康生長(zhǎng)的病毒，也曾引起過(guò)人類的感染，需要各級(jí)部門對(duì)其高度重視[4]。

禽流感給禽類養(yǎng)殖戶帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失很大，防治禽流感的重要措施是疫苗免疫。疫苗接種后抗體產(chǎn)生的水平高低直接影響免疫的效果[5]。禽流感對(duì)雞紅細(xì)胞具有良好的凝集作用，檢測(cè)禽流感抗體的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)室方法是血凝抑制試驗(yàn)，并被廣泛使用。AIV-HI效價(jià)檢測(cè)方法對(duì)疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)和最佳免疫時(shí)機(jī)的確定都具有重要意義。ELISA檢測(cè)目前已經(jīng)趨于標(biāo)準(zhǔn)化，也是檢測(cè)禽流感的一種常用方法，其特異性和敏感性高、成本低，已被廣泛用于臨床的診斷檢測(cè)。為有效控制禽流感在林芝市的發(fā)生與流行，確保雞禽流感疫苗免疫效果，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)和ELLISA雙重試驗(yàn)，探討了禽流感抗體在藏雞體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，為制定西藏林芝地區(qū)藏雞禽流感最佳免疫程序提供有效的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 西藏農(nóng)牧學(xué)院臨床獸醫(yī)樓養(yǎng)殖的86只藏雞，并對(duì)其進(jìn)行禽流感疫苗免疫接種。

1.1.2 免疫疫苗 雞禽流感、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La-sota株+H120株），批號(hào)：201631，生產(chǎn)日期：20170603，有效期18個(gè)月；雞禽流感、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗（La-sota株+M41株+HZ株），批號(hào)：201705，生產(chǎn)日期：20170616，有效期12個(gè)月；重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9-Re1株），批號(hào)：201703，生產(chǎn)日期：20170618，有效期：12個(gè)月；雞禽流感、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗（La-sota株+M41株+HZ株），批號(hào)：201705，生產(chǎn)日期：20170616，有效期：12個(gè)月。以上所有疫苗均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 免疫程序 禽流感疫苗免疫程序見(jiàn)表1。

1.1.4 血清樣品 2018年7月20日對(duì)西藏農(nóng)牧學(xué)院臨床獸醫(yī)樓養(yǎng)殖的5日齡藏雞進(jìn)行首免，2018年8月15號(hào)完成三次免疫。免疫全部結(jié)束后每隔2周隨機(jī)選取20只藏雞，翅下靜脈采血2 ml。共采血14次。將采集好的血液靜置30 min后，4 000 r/min，離心15 min后吸取上層血清移至滅菌的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 試驗(yàn)儀器與試劑 雞禽流感病毒（AIV）抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳市芬德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：E320106。恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、振蕩儀、96孔微量板、微量加樣槍、微型振蕩器、超純水均由西藏農(nóng)牧學(xué)院臨床大樓實(shí)驗(yàn)室提供，雞禽流感標(biāo)準(zhǔn)抗原，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗體數(shù)值檢測(cè) 嚴(yán)格按照禽流感病毒（AIV）ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)

表1 藏雞禽流感免疫程序

1.2.2.1 1%紅細(xì)胞懸浮液的配制 隨機(jī)選取1只成年藏雞，無(wú)菌抗凝管，翅下靜脈采血10 ml，1 700 r/min離心8 min，棄上層血清和白細(xì)胞層，加入15 ml生理鹽水，再次1 700 r/min離心8 min，棄上清液，以上操作重復(fù)3至4次直至上清液透明。操作完畢之后，微量加樣槍吸取5 μl紅細(xì)胞加入495 μl生理鹽水中，充分混勻，即制成1%紅細(xì)胞懸浮液。放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩２怀^(guò)5天。

1.2.2.2 血凝（HA）試驗(yàn) 用96孔微量反應(yīng)板，1～12孔每孔加入25 μlPBS，其中12孔為對(duì)照組。吸取25μl病毒懸液加入第1孔混勻，倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μl棄去，然后每孔加入25μl的PBS，最后每孔再加入1%的紅細(xì)胞懸液25μl，震蕩混勻，室溫靜置40 min，對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底，觀察結(jié)果。

1.2.2.3 配制4個(gè)血凝單位的抗原（4HUA） 能使紅細(xì)胞全部凝集（100%凝集，＋＋＋＋）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為一個(gè)血凝單位（HUA)。以完全血凝病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為配制含4個(gè)血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。

1.2.2.4 血凝抑制（HI）試驗(yàn) 在微量反應(yīng)板上，1～11孔各加入25 μl PBS，第12孔加入50 μl PBS，然后第1孔加入25 μl待檢血清，倍比稀釋至第11孔，棄去25 μl，1～11孔各孔均加入上述配制的4個(gè)血凝單位的標(biāo)準(zhǔn)病毒懸液25 μl，室溫靜置30 min，最后每孔加入25 μl的1%雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，室溫靜置40 min，判定結(jié)果。以完全抑制最高稀釋倍數(shù)為HI滴度。通過(guò)血凝實(shí)驗(yàn)確定禽流感抗原的血凝效價(jià)，采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)對(duì)血清樣品進(jìn)行禽流感抗體檢測(cè)。

表2 雞禽流感抗體合格率和抗體效價(jià)

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 ELISA實(shí)驗(yàn)判定方法

實(shí)驗(yàn)正常的情況下，陰性對(duì)照吸光值≥1.0，陽(yáng)性對(duì)照吸光值≤陰性對(duì)照吸光值×50%。

以PI值為判定結(jié)果，PI(阻斷值）=（1-樣品值/陰性對(duì)照孔均值）×100%，PI≥50%為陽(yáng)性；PI＜50%為陰性。根據(jù)PI值高低可作為抗體水平強(qiáng)、中、弱的估算。

1.3.2 HA結(jié)果判斷

＋＋＋＋：紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集；＋＋＋：紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈；＋＋：紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊；＋：紅細(xì)胞于孔底形成小圓點(diǎn)，四周有少許凝集塊 ；－：紅細(xì)胞于孔底呈小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，即紅細(xì)胞完全不凝集。

1.3.3 HI結(jié)果判定

以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清抗體滴度。根據(jù)GBT18931-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》制定的檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行判定，禽流感H1抗體效價(jià)≥4log2為免疫合格[6]。

2 結(jié)果

2.1 血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

血凝抑制實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2和圖1。表2表明，在按程序完成三次免疫后第6周抗體合格率（100%）大于標(biāo)準(zhǔn)值70%，一直持續(xù)到第24周，第24周降至標(biāo)準(zhǔn)值以下；圖1表明，在按程序完成三次免疫后第2周，抗體水平迅速上升。第10周抗體水平達(dá)到高水平并維持至第20周。直到第24周，抗體水平降至臨界值附近，而第26周，抗體效價(jià)已下降到1log2，28周抗體水平幾乎接近0，均表明無(wú)抗體存在。只有在第4周至第24周，檢測(cè)的所有藏雞血清中的抗體數(shù)值（PI）平均數(shù)值都在50%以上，抗體效價(jià)平均值都在4log2以上，并且抽檢合格率都大于70%，符合國(guó)家農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)。按本防疫程序防疫禽流感后，有效抗體在藏雞體內(nèi)維持時(shí)間為5個(gè)半月。

圖1 不同日期藏雞體內(nèi)禽流感抗體效價(jià)值走勢(shì)

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）結(jié)果

ELISA結(jié)果見(jiàn)圖2，本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性值分別為1.85635和1.7646，陰性值分別為0.6315和0.7271，陰性對(duì)照吸光值≥1.0，陽(yáng)性對(duì)照吸光值≦陰性對(duì)照吸光值×50%，所以本實(shí)驗(yàn)成立。對(duì)每次隨機(jī)試驗(yàn)的20只藏雞數(shù)據(jù)進(jìn)行整理取其均值，由圖1可知31日齡藏雞完成三次免疫，經(jīng)2周后，抗體水平迅速上升。在第10～20周，抗體水平達(dá)到高峰，持續(xù)保持在一定水平。從20周開(kāi)始時(shí)，抗體水平開(kāi)始逐漸下降，直到第28周時(shí)，抗體水平降至臨界值附近。

圖2 不同日期藏雞體內(nèi)禽流感抗體PI值走勢(shì)圖

3 討論與分析

禽流感是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的傳染病之一，野生水禽也極易感染，人也可感染[7]?；疾‰u具有典型的精神委頓，飲水量、采食量下降，流淚、腫頭，眼睛不圓內(nèi)有泡沫、冠發(fā)紫[8]。病雞的體溫升高, 羽毛暗淡無(wú)光, 呈現(xiàn)一種松亂的狀態(tài)，患雞的雞冠顏色也變暗, 大量分泌物存在鼻腔內(nèi), 并伴有頭部咳嗽、水腫以及結(jié)膜發(fā)炎癥狀。有些患雞會(huì)會(huì)有抽搐、痢疾癥狀，產(chǎn)蛋量下降明顯[9]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，ELISA的結(jié)果和抗血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果的走勢(shì)規(guī)律是一致的。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）PI數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，31日齡藏雞完成三次免疫后的第2周，抗體才開(kāi)始迅速上升。在第10周至第20周，抗體水平達(dá)到高峰，維持平穩(wěn)時(shí)間長(zhǎng)。在第28周時(shí)，抗體水平已經(jīng)接近臨界值。此時(shí)血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）的抗體效價(jià)已經(jīng)下降到1log2，小于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部標(biāo)準(zhǔn)4log2，此時(shí)已經(jīng)達(dá)不到抵抗禽流感病毒的能力，存在風(fēng)險(xiǎn)。建議進(jìn)行下一次免疫。血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）的抗體效價(jià)只有在第4周至第24周，抗體效價(jià)平均值都在4log2以上，并且抽檢合格率都大于70%，符合標(biāo)準(zhǔn)，且檢測(cè)的所有藏雞血清中的抗體數(shù)值（PI）平均數(shù)值都在50%以上，數(shù)據(jù)顯示禽流感有效抗體在藏雞體內(nèi)維持時(shí)間為5個(gè)半自然月。第24周（2月15日）時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）PI數(shù)據(jù)為60%，即使大于標(biāo)準(zhǔn)線50%，但此時(shí)血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的抗體效價(jià)已經(jīng)接近臨界值附近，應(yīng)該進(jìn)行下一次免疫。

禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)是目前實(shí)驗(yàn)室中最常用的檢測(cè)免疫抗體方法之一，但血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法在操作中常有較多的影響因素，容易造成試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差[10]。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)有高度的活性和靈敏性的優(yōu)勢(shì)，在僅做酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)檢測(cè)禽流感抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律時(shí)，當(dāng)PI值為60%時(shí)，需要對(duì)藏雞進(jìn)行下一次免疫，如果等PI值降至50%時(shí)，雖然結(jié)果為陽(yáng)性，但此時(shí)雞群體內(nèi)的抗體已經(jīng)不足以抵御禽流感病毒。所以一定要在大于標(biāo)準(zhǔn)值50%之前進(jìn)行下一次免疫，以減少經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

本研究彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)西藏林芝地區(qū)禽流感抗體在藏雞體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律空白，科學(xué)評(píng)價(jià)雞禽流感疫苗的免疫效果，合理制定雞場(chǎng)禽流感免疫程序。本實(shí)驗(yàn)采用血凝實(shí)驗(yàn)(HA)、血抑制實(shí)驗(yàn)(HI)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)藏雞體體抗體水平。發(fā)現(xiàn)按本防疫程序防疫禽流感后，禽流感有效抗體在藏雞體內(nèi)維持時(shí)間為5個(gè)半自然月，建議完成三次免疫程序后第24周進(jìn)行下一次免疫。這為制定西藏林芝地區(qū)最佳藏雞禽流感免疫程序提供有效的參考依據(jù)。