龔賽賽，魏佳歡，譚海川，黃艷宏，潘 立，蔡葵蒸*

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

現(xiàn)階段世界各地對(duì)家畜胃腸道寄生線蟲的防治幾乎完全依賴于化學(xué)驅(qū)蟲藥，如阿維菌素、苯并咪唑、左旋咪唑等，隨著驅(qū)蟲藥的不斷使用，寄生蟲抗藥性不斷增強(qiáng)，驅(qū)蟲藥的大量使用給自然環(huán)境造成了一定污染，而且會(huì)導(dǎo)致畜產(chǎn)品中有一定的化學(xué)藥物殘留，從而對(duì)人畜的健康產(chǎn)生威脅[1,2]。因此，很多科學(xué)家在抗寄生蟲家畜品種的培育、草場(chǎng)管理系統(tǒng)、開發(fā)寄生線蟲疫苗以及利用食線蟲性真菌的生物防治等方面投入了大量精力。為了克服寄生蟲抗藥性逐漸增強(qiáng)，通過(guò)生物之間存在的拮抗作用防治這些動(dòng)物疫病是非常具有可行性，而且利用食線蟲性真菌對(duì)寄生性線蟲進(jìn)行生物防治不但技術(shù)難度小，還比較直接有效[3,4]。隨著捕食線蟲性真菌的出現(xiàn)，科學(xué)家們利用其與寄生線蟲之間的拮抗作用，進(jìn)而對(duì)家畜胃腸道的寄生性線蟲進(jìn)行捕殺，從而發(fā)現(xiàn)了食線蟲性真菌巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值[5,6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已發(fā)現(xiàn)有200多種真菌具有捕食線蟲的能力，真菌可以利用其特殊的結(jié)構(gòu)殺死自由生活線蟲，而且其分布范圍也特別廣泛[7-10]。本研究的目的是利用西北民族大學(xué)蔡葵蒸教授課題組分離鑒定并提供的編號(hào)為 F088的食線蟲性真菌為材料探究其孢子在不同滲透壓下的萌發(fā)情況，以便為今后更好地利用這種捕食線蟲性真菌進(jìn)行動(dòng)物寄生線蟲病的防治及相關(guān)疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源

食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans來(lái)自于西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院蔡葵蒸教授實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)，選用的菌株的編號(hào)為F088。

1.2 制備培養(yǎng)基

1.2.1 2%麩皮液體培養(yǎng)基(WB) 1000 ml蒸餾水中加入新鮮麩皮20 g，微火煮沸1 h，補(bǔ)足沸騰過(guò)程丟失的水分待冷卻后數(shù)層紗布過(guò)濾并于4℃冰箱過(guò)夜取上清液分瓶后121℃，20 min 高壓滅菌備用。

1.2.2 2%水瓊脂培養(yǎng)基（Water Agar，WA）1 000 ml涼開水中加入瓊脂粉20 g，121℃高壓滅菌20 min后傾注于玻璃培養(yǎng)皿中待凝固后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基 (CMA) 于1 000 ml蒸餾水中加入新鮮玉米粉40 g微火煮沸1 h，補(bǔ)足沸騰過(guò)程丟失的水分。數(shù)層紗布過(guò)濾并置于冰箱（4℃）沉淀12 h，取上清液并調(diào)節(jié)濃度至0.4 g/L，經(jīng)121℃，20 min高壓滅菌后傾注于培養(yǎng)皿中凝固后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA） 新鮮土豆去皮切塊后稱取20 g，加入1 000 ml蒸餾水中微火煮沸1 h，補(bǔ)足沸騰過(guò)程丟失的水分，冷卻后數(shù)層紗布過(guò)濾并于4℃冰箱過(guò)夜取上清液備用，分瓶后加入2%的瓊脂粉，然后根據(jù)需要分別加入0%、5%、10%、20%的NaCl固體從而獲得一個(gè)滲透壓的梯度，最后經(jīng)121℃，20 min 高壓滅菌后，傾注于培養(yǎng)皿中凝固后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 真菌的分離純化

從4℃冰箱中取出保存有菌株編號(hào)為 F088的2%的玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基在無(wú)菌條件下使用接種針將適量的菌絲接種于2% WA瓊脂平板培養(yǎng)基的中央位置，然后在25℃的條件下培養(yǎng)1周后挑取分生孢子至0.4%CMA瓊脂平板培養(yǎng)基中連續(xù)純化多次，直至獲得食線蟲性真菌F088的純培養(yǎng)物。

1.4 真菌的培養(yǎng)

取出保存有捕食線蟲性真菌F088純培養(yǎng)物的CMA平板，然后在無(wú)菌條件下使用接種環(huán)或是接種針也可以是無(wú)菌的接種刀挑去適量菌絲或是大小合適的瓊脂塊接種到2%麩皮液體培養(yǎng)基中然后放置在搖床上在28℃和160 rmp的條件下培養(yǎng)8 d。8 d后再一次在無(wú)菌條件下使用移液管將適量的菌液接入到固體糧食培養(yǎng)基中在28℃的條件下培養(yǎng)21 d。

1.5 孢子的收集

在無(wú)菌條件下從糧食培養(yǎng)基中根據(jù)需要取出適量的糧食固體放置在一個(gè)三角瓶里。首先用長(zhǎng)鑷子將糧食盡量夾碎然后向三角瓶中加入配置并高壓好的0.1%的吐溫80直至瓶中的糧食固體完全浸沒為止，然后在震蕩儀上充分震蕩讓菌絲及孢子從糧食表面脫落，充分混勻后用一小燒杯取適量孢子洗脫液然后利用超聲波使孢子和菌絲分離。將超聲處理后的孢子洗脫液裝入10 ml離心管中在離心機(jī)上以1 000 r/min離心5 min，此操作需重復(fù)3～5次，直到將殘留的吐溫洗凈為止。離心完畢后用移液槍吸取20 ul孢子液在顯微鏡下計(jì)數(shù)孢子量并計(jì)算離心管中孢子的濃度然后根據(jù)需要將孢子濃度調(diào)節(jié)至合適的濃度（1 500個(gè)/ml左右為宜），最后將孢子放置在4℃冰箱保存?zhèn)溆茫楸ＷC孢子活性要盡快使用）。

1.6 孢子的涂布、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

用移液槍吸取300 ul孢子液注到制備好的不同滲透壓的PDA平板上并用涂布棒涂勻，每個(gè)滲透壓做3個(gè)平行編號(hào)為1、2、3、4（1號(hào)為對(duì)照組2、3、4滲透壓依次升高）。然后使用封口膜將9個(gè)平板封口最后放置在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)孢子的萌發(fā)率。計(jì)數(shù)孢子時(shí)可用刀或是打孔器切去大小合適的PDA瓊脂塊直接在顯微鏡下計(jì)數(shù)也可經(jīng)棉蘭染色液染色后再計(jì)數(shù)。

表1 食線蟲真菌F088分生孢子不同滲透壓下萌發(fā)率

2 結(jié)果與分析

由表1看出食線蟲真菌F088分生孢子在PDA平板上在28℃的條件下培養(yǎng)24 h后其平均萌發(fā)率可達(dá)67.35%，同樣的培養(yǎng)條件下在加了5% NaCl的PDA平板上的平均萌發(fā)率為3.65%，在加了10%NaCl的PDA平板上的平均萌發(fā)率為2.13%，在加了20%NaCl的PDA平板上的平均萌發(fā)率僅僅為1.10%，從這幾組數(shù)據(jù)中可以看到隨著培養(yǎng)基滲透壓的不斷升高孢子的萌發(fā)率是明顯降低的。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明食線蟲真菌F088其孢子的萌發(fā)率與培養(yǎng)基中滲透壓的高低有關(guān)，在培養(yǎng)基中加了5%NaCl后它的萌發(fā)率有非常明顯的降低，由對(duì)照組的67.365%下降為3.65%，并隨著培養(yǎng)基中NaC含量的增加即培養(yǎng)基中滲透壓的升高而繼續(xù)降低，當(dāng)培養(yǎng)基中的NaC含量增加至20%是孢子的萌發(fā)率僅為1.10%。

3 結(jié)語(yǔ)

胃腸道寄生線蟲病是危害家畜健康成長(zhǎng)的主要寄生蟲病。隨著寄生線蟲對(duì)化學(xué)驅(qū)蟲藥抗藥性的不斷增強(qiáng)，尋找驅(qū)蟲藥的替代或補(bǔ)充方法已經(jīng)顯得尤為重要，而利用食線蟲真菌對(duì)動(dòng)物寄生蟲的拮抗作用而控制這類動(dòng)物疫病是目前最有前景的選項(xiàng)。當(dāng)前已發(fā)表的研究成果中有對(duì)食線蟲真菌生長(zhǎng)及捕食環(huán)境的報(bào)道，比如對(duì)生長(zhǎng)溫度的要求、對(duì)pH的適應(yīng)性、對(duì)培養(yǎng)基中的養(yǎng)分以及各種離子含量的需求。但是并未見對(duì)其孢子在不同滲透壓下萌發(fā)情況的研究，本實(shí)驗(yàn)利用D. flagrans中編號(hào)為F088的菌株為研究材料對(duì)其分生孢子在不同滲透壓下的生長(zhǎng)狀況做了一個(gè)簡(jiǎn)單的探究，對(duì)食線蟲真菌的生長(zhǎng)條件做了一個(gè)簡(jiǎn)單的補(bǔ)充，為以后菌株的分離純化培養(yǎng)以及對(duì)優(yōu)質(zhì)菌株的選擇提供簡(jiǎn)要參考。