1株大蒜內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗病原真菌活性

范飛　李樂溪　鞠秀云　蘇奕人　蔣繼宏　楊緒勤

摘要：大蒜（Allium sativum L.）為百合科蔥屬多年生草本植物，富含生物活性成分及營養(yǎng)物質(zhì)。采用組織分離法對新鮮健康的大蒜蒜瓣進行內(nèi)生真菌的分離純化，獲得一株乳白色真菌KLBMPGC013;通過形態(tài)特征和ITS序列分析鑒定該菌株為白地霉（Geotrichum candidum）;將該菌株菌懸液接種在健康大蒜蒜瓣上進行培養(yǎng)，大蒜蒜瓣未出現(xiàn)明顯病斑，說明該菌株對大蒜無致病性影響;以4種植物病原真菌為指示真菌檢測該菌株的抑菌活性，結(jié)果顯示，該菌株能抑制2種指示真菌的生長;采用蒽酮硫酸法檢測該菌株產(chǎn)胞外多糖含量，結(jié)果顯示，其胞外多糖濃度為2.89 mg/mL。通過提取該菌株胞外粗多糖并檢測其抑菌活性發(fā)現(xiàn)，該內(nèi)生真菌粗多糖對大蒜白腐小核菌的抑制作用較好，對西瓜殼二孢稍有抑制作用。

關(guān)鍵詞：大蒜;白地霉;抗病原真菌活性;分離純化;ITS序列分析

中圖分類號：S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0156-04

植物內(nèi)生真菌是生活在健康植物組織內(nèi)部并不表現(xiàn)出外在癥狀的微生物，它們從寄主植物上獲得營養(yǎng)和保護，而寄主植物可以從增強的競爭能力和對草食動物、病原體和各種非生物脅迫的抗性中受益，具有豐富的生物多樣性[1-2]。植物內(nèi)生真菌已知的種類繁多，而且還有許多植物內(nèi)生真菌有待開發(fā)和研究，是新型的藥物資源，具有潛在的應(yīng)用價值。近年來的研究表明，幾乎所有植物體內(nèi)都存在著內(nèi)生真菌，它們主要生長在植物的根、莖、葉、果實和種子等器官的皮下組織中。植物內(nèi)生真菌和宿主植物協(xié)同進化、互惠共生[3-4]，它們可以產(chǎn)生大量對現(xiàn)代醫(yī)學、農(nóng)業(yè)和工業(yè)有潛在應(yīng)用價值的次生代謝產(chǎn)物，包括新型抗生素、抗藥物、免疫制劑和抗癌化合物等[5-6]。汪涯等從蛇足石杉葉片中分離的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的黃曲霉具有抗老年癡呆和顯著提高記憶力的功效[7]。一些藥用植物內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)，研究人員從白苞蒿[8]、堿蓬[9]、海南粗榧[10]等藥用植物中分離出了能產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。

大蒜（Allium sativum L.）屬于百合科蔥屬，有“天然抗生素”的美稱，是重要的藥食同源植物[11]。大蒜中含有豐富的大蒜素、大蒜多糖、蒜氨酸酶等對人體健康十分有益的成分，已有研究證明，大蒜具有降血脂、降血糖、增強免疫力、防癌抗癌、延緩衰老等重要的生理功能，且在食品、藥品以及化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力[12-13]。目前，關(guān)于大蒜的研究熱點主要集中在大蒜提取物和殺菌抑菌方面，而對大蒜內(nèi)生真菌的研究還有待深入。本研究從新鮮大蒜蒜瓣中分離得到一株內(nèi)生真菌，研究該真菌抑制植物病原菌活性以及產(chǎn)胞外多糖的能力，提取該真菌胞外粗多糖并檢測其抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物樣品

本試驗所用大蒜采自江蘇省徐州市邳州市宿羊山鎮(zhèn)大蒜種植基地。本試驗所用大蒜個頭大、品質(zhì)好、肉質(zhì)脆、無蟲孔及病害癥狀，有地域特色，具有說服力。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基——馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 L，瓊脂20 g，pH值自然。

對照培養(yǎng)基——LB固體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸出粉5 g，去離子水1 L，瓊脂20 g，pH值為7.0～7.2。

富集培養(yǎng)基——馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 L，pH值自然。

1.1.3 目標菌株 試驗所用植物病原真菌有白腐小核菌（Sclerotium cepivorum Berk.）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、西瓜殼二孢（Ascochyta citrullina Smith），均由江蘇師范大學江蘇省藥食植物生物技術(shù)國家重點實驗室提供。

1.1.4 Sevag試劑的配制 三氯甲烷與正丁醇體積比為 4 ∶1。

1.1.5 試驗儀器

GC-250型恒溫光照培養(yǎng)箱（上海悅豐儀器儀表有限公司）;HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）;UV-8000A型雙光束紫外可見分光光度計;DC-52生物顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜內(nèi)生真菌的分離純化

采用組織切塊法對大蒜進行內(nèi)生真菌分離[14]。將新鮮大蒜去皮后，用去離子水沖洗10 min，在無菌環(huán)境下將大蒜用次氯酸鈉溶液浸泡5 min，75%乙醇漂洗20 s，無菌生理鹽水沖洗2次，無菌水沖洗1次。取最后1次沖洗的無菌水100 μL涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)1 d，如無菌生長，表明表面消毒成功，可進行后續(xù)試驗。將經(jīng)過表面消毒處理的大蒜樣品在無菌環(huán)境下切成約0.5 cm3的小組織塊，均勻嵌插進PDA培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)7～10 d后，從分離平板上挑取真菌菌落接種在新的分離純化培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。反復(fù)進行純化培養(yǎng)，直至獲得單一菌株，進行常規(guī)保種、備用。

1.2.2 菌種鑒定

將分離得到的1株可產(chǎn)生胞外多糖的菌株在PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察菌落特征。挑取該菌株純培養(yǎng)產(chǎn)孢的內(nèi)生真菌制片，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。提取該菌株總DNA，采用ITS全序列通用引物進行PCR擴增，產(chǎn)物測序后將ITS全序列在NCBI網(wǎng)站中進行Blast比對分析;用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株潛在致病性測定

將培養(yǎng)5 d的菌株用無菌水制成菌懸液，在550 nm處測定吸光度。將新鮮健康的大蒜蒜瓣以分離內(nèi)生菌的方式進行表面消毒。在無菌環(huán)境下用消毒刀片在大蒜蒜瓣上橫向劃3道刀口，分別涂上該菌株菌懸液，以無菌水作對照[15]。在無菌培養(yǎng)皿中平鋪脫脂棉，噴無菌水保濕，將處理過的蒜瓣鋪在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，共作5個平行樣。28 ℃下培養(yǎng)7 d，每天觀察蒜瓣變化，是否出現(xiàn)病變。

1.2.4 抑菌活性檢測

以白腐小核菌、茄鏈格孢、蘋果輪紋病菌、西瓜殼二孢4種植物致病真菌為指示真菌，用0.5 cm打孔器制成菌餅。利用平板對峙法，挑取一塊菌餅放置在PDA培養(yǎng)基一側(cè)，在距離菌餅3 cm處接種“1.2.2”節(jié)中的內(nèi)生真菌，于 28 ℃ 培養(yǎng)5～7 d，觀察內(nèi)生真菌是否抑制指示真菌生長。

1.2.5 胞外多糖含量測定——蒽酮硫酸法

胞外多糖的制備：挑取一塊菌體于300 mL PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)2 d制成種子液。分別吸取1%種子液于500 mL PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)7 d，共發(fā)酵10 L。將發(fā)酵液于離心機中4 000 r/min離心5 min，得到的上清液即是含胞外多糖的溶液。

葡萄糖標準曲線制作：準確稱取葡萄糖0.01 g溶于 100 mL 去離子水中，制備葡萄糖標準品溶液;準確稱取0.1 g蒽酮溶于50 mL濃硫酸中，制備蒽酮硫酸溶液。從葡萄糖標準品溶液中分別吸取50、100、200、300、400、600、800 μL，置具塞刻度試管中，分別加去離子水定容至1 mL。以葡萄糖溶液 ∶蒽酮硫酸溶液（體積比）為1 ∶3的比例在每瓶葡萄糖溶液中加入3 mL蒽酮硫酸溶液。搖勻后100 ℃水浴加熱 15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水為空白對照，在最大吸收波長（620 nm）處測定相應(yīng)的吸光度，每個濃度測3次。以吸光度為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制葡萄糖標準曲線。

待測菌株胞外多糖溶液的配制：吸取50 μL內(nèi)生真菌胞外多糖溶液溶于950 μL去離子水中，稀釋20倍，然后加入 3 mL 蒽酮硫酸溶液混勻，共測3個平行樣。

胞外多糖含量的測定：將待測溶液于100 ℃條件下水浴中加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水為空白對照，在最大吸收波長（620 nm）處測定相應(yīng)的吸光度，并通過繪制的葡萄糖標準曲線計算該內(nèi)生真菌胞外多糖含量。

1.2.6 內(nèi)生真菌胞外多糖的粗提取

收集胞外多糖溶液，將10 L體積溶液濃縮至1 L。加入4倍體積的95%乙醇混合后靜置一夜，之后離心，保留沉淀。用5體積的去離子水將沉淀復(fù)溶、離心，取上清。加入占該上清溶液體積1/4的Sevag試劑高速攪拌20 min后倒入分液漏斗中，待分層后留上清，并將該步驟重復(fù)3次。加入4倍體積的95%乙醇，用布氏漏斗過濾，保留沉淀。用95%乙醇在布氏漏斗上洗滌沉淀2次，自然揮發(fā)乙醇，即得到粗多糖。

1.2.7 內(nèi)生真菌粗多糖的抑菌活性檢測

取10 mg粗多糖溶于1 mL去離子水中，用0.22 μm濾頭過濾成無菌溶液。在PDA平板內(nèi)1側(cè)放置1枚無菌牛津杯，加入100 μL粗多糖溶液，在距離牛津杯3 cm處接種1塊植物病原菌菌餅，28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察內(nèi)生真菌粗多糖是否抑制指示真菌生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜內(nèi)生真菌的分離

采用組織切塊法對大蒜蒜瓣進行內(nèi)生真菌分離，在進行反復(fù)純化后共獲得純培養(yǎng)內(nèi)生真菌9株，發(fā)現(xiàn)其中1株真菌KLBMPGC013可產(chǎn)生胞外多糖，因此將該菌株作為進一步研究的大蒜內(nèi)生真菌菌株。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

由圖1可知，菌株KLBMPGC013在PDA培養(yǎng)基上生長狀況良好，菌株為乳白色，絨毛狀，孢子發(fā)達。通過光學顯微鏡觀察該菌株孢子形狀為橢圓形（圖2）。

2.2.2 菌株的分子鑒定

將內(nèi)生真菌KLBMPGC013的ITS序列測定結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為KY103456.1。將菌株KLBMPGC013的DNA序列與GenBank中相關(guān)序列進行Blast序列相似性比對，采用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對其進行分析。由圖3可知，菌株KLBMPGC013與白地霉（Geotrichum candidum）的進化距離最近，因此鑒定該菌株為白地霉。

2.3 內(nèi)生真菌潛在致病性分析

在培養(yǎng)過程中，每天對經(jīng)過KLBMPGC013菌株菌懸液涂抹的蒜瓣刀口進行觀察，7 d后觀察發(fā)現(xiàn)，5組樣品與對照一樣，并未出現(xiàn)異常病斑（圖4）。

將蒜瓣刀口處做切片處理，在光學顯微鏡下觀察，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，對照蒜瓣切片與接菌蒜瓣切片相比無明顯差異，這均說明該菌株對大蒜無致病性。

2.4 內(nèi)生真菌抑菌活性檢測

通過平板對峙法觀察菌株KLBMPGC013對4種指示真菌生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)該菌株可抑制白腐小核菌的生長，并出現(xiàn)抑菌圈;對西瓜殼二孢的抑制作用較小，而對蘋果輪紋病菌和茄鏈格孢無抑制作用（圖6為菌株KLBMPGC013對大蒜白腐小核菌的抑制作用）。

2.5 內(nèi)生真菌胞外多糖含量測定結(jié)果

根據(jù)葡萄糖標準曲線y=11.783 0x+0.030 8，r2=0.990 6，計算得到該菌株產(chǎn)多糖含量較高，為2.89 mg/mL。

2.6 內(nèi)生真菌胞外粗多糖抑菌活性檢測結(jié)果

通過平板對峙法觀察菌株KLBMPGC013胞外粗多糖對4種指示真菌生長的抑制效果，結(jié)果顯示，該菌株胞外粗多糖對大蒜白腐小核菌的抑制作用較好，對西瓜殼二孢稍有抑制效果，而對蘋果輪紋病菌和茄鏈格孢無抑制作用（圖7為菌株KLBNPGC013胞外粗多糖對大蒜白腐小核菌和西瓜殼二孢的抑制作用）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對新鮮大蒜的內(nèi)生真菌進行分離純化，獲得9株內(nèi)生真菌，通過篩選獲得1株產(chǎn)胞外多糖的真菌菌株KLBMPGC013。結(jié)合菌株KLBMPC013的表型特征，經(jīng)ITS序列分析，將該菌株鑒定為白地霉。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對大蒜無致病性影響且對2種植物病原真菌有抑制效果。由于該真菌產(chǎn)胞外多糖含量較高，因此提取該菌株胞外粗多糖并檢測其抑菌活性，結(jié)果表明，該菌株具有抑菌活性是因為其胞外粗多糖具有抑菌效果。由于植物內(nèi)生真菌具有穩(wěn)定的生存空間、不易受外界影響，能直接作用于病原菌，在生物防治領(lǐng)域占有重要地位。因此對于KLBMPGC013菌株抑制植物病原真菌的效果，在后續(xù)研究中可以通過盆栽試驗來進行更加準確地檢測。此外，對于該菌株胞外多糖的其他生物活性也可以進行檢測和深入研究。

很多藥用植物具有豐富的生物多樣性，是人類開發(fā)利用的重要資源。植物內(nèi)生菌與藥用植物的協(xié)同進化關(guān)系決定了某些內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力[16]。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物制藥和食品發(fā)酵等方面都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，受到廣泛關(guān)注。白地霉菌具有許多可利用的價值，其菌體蛋白營養(yǎng)價值很高，可食用、可作飼料，也可提取核酸，還可以合成脂肪。Boutrou等研究表明，白地霉多樣的代謝途徑在奶酪的成熟過程中起重要作用，并通過酶活性促進奶酪風味的發(fā)展[17]。劉天明等利用白地霉發(fā)酵產(chǎn)品對小鼠進行急性毒性試驗、骨髓細胞微核試驗、小樹精子畸形試驗和30 d喂養(yǎng)試驗，結(jié)果表明，白地霉菌株發(fā)酵產(chǎn)品具有較好的飲用安全性[18]。Assas等利用阿達瑪矩陣研究發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，白地霉菌對橄欖油廢水中化學需養(yǎng)量（COD）的去除率達到70%，而且廢液中部分多酚化合物也被氧化降解[19]。白地霉可用于白酒生產(chǎn)，使原酒口感純正、甘甜、柔軟，品質(zhì)得到顯著改善[20]。白地霉作為一種極具潛力的菌種在多個領(lǐng)域都有開發(fā)利用價值，正確地運用它、挖掘它，可為我們的社會帶來巨大的經(jīng)濟效益。

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