單孢繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢生長和產(chǎn)孢的影響

劉華嬌　谷青　趙冬梅　張岱　潘陽　楊志輝　朱杰華

摘要：繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢（Alternaria solani）的形態(tài)、菌落顏色、生長和產(chǎn)孢等生物學性狀均會產(chǎn)生影響。經(jīng)過連續(xù)單孢分離和培養(yǎng)，獲得茄鏈格孢的2次繼代培養(yǎng)菌株。隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，角變現(xiàn)象呈上升趨勢，F(xiàn)1、F2代菌株出現(xiàn)角變現(xiàn)象的概率分別為23.33%、52.50%。通過十字交叉法和系列稀釋法分別測定繼代培養(yǎng)菌株的生長情況和產(chǎn)孢量。結(jié)果表明，無性F1、F2代與親代相比，其生長量和產(chǎn)孢量均呈下降趨勢，且F2代下降百分率更高。與親代菌株相比，F(xiàn)1代的生長量下降1.25%～7.61%，F(xiàn)2代生長量下降10.07%～22.29%;F1代菌株單位面積產(chǎn)孢量降低 12.80%～84.60%，F(xiàn)2代菌株單位面積產(chǎn)孢量下降80.11%～96.50%，且產(chǎn)孢量與菌落顏色深淺密切相關(guān)，菌落顏色較深的菌株分生孢子單位面積的產(chǎn)孢量要高于菌落顏色淺的菌株。表明茄鏈格孢無性后代活力不斷降低。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯早疫病;繼代培養(yǎng);生長量;產(chǎn)孢量;角變

中圖分類號： S435.32文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0160-03

由茄鏈格孢（Alternaria solani）引起的馬鈴薯早疫病是影響我國馬鈴薯生產(chǎn)的重要真菌病害之一。嚴重時，該病對馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)造成的損失可達70%～80%[1]。馬鈴薯早疫病是一種氣傳多循環(huán)流行性病害，病菌對環(huán)境的適應能力強。自茄鏈格孢被報道以來，前人的研究多集中在其生物性狀、侵染方式、藥效防治等方面，關(guān)于實驗室條件下單孢繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢生長情況及適應能力的影響國內(nèi)外未見報道。

研究表明，繼代培養(yǎng)可引起蟲草、白僵菌等微生物的變異和生物學特性的改變。劉荻等發(fā)現(xiàn)，北蟲草的組織分離株在繼代培養(yǎng)中會發(fā)生明顯的角變[2]。劉海英等發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)會造成玉米大斑病菌的菌絲生長速度變慢，產(chǎn)孢量降低[3]。張慧等研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌產(chǎn)孢量隨繼代培養(yǎng)代數(shù)呈指數(shù)下降趨勢[4]。許志斌對綠僵菌進行研究發(fā)現(xiàn)，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增多，菌株的產(chǎn)孢量逐漸降低[5]。孫召朋通過繼代培養(yǎng)降低了白僵菌對玉米螟的毒力[6]。唐曉慶等研究發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)能逐漸增強球孢白僵菌的抗旱能力[7]。

Meng等分析發(fā)現(xiàn)，茄鏈格孢病菌的遺傳變異很高，推測其可能存在隱藏的有性生殖[8]。除有性生殖外，還有一種可能是茄鏈格孢存在準性生殖現(xiàn)象，使病菌的遺傳變異增高。單孢分離技術(shù)在病原真菌遺傳特性、致病力分化等研究中有重要作用。單孢分離可以獲得純菌種，有利于更好地研究菌株的遺傳變異。本試驗通過對茄鏈格孢的單孢分離及其后代的繼代培養(yǎng)，比較親代與后代之間生長和產(chǎn)孢的差異，分析繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢的影響，旨在為說明茄鏈格孢較高的遺傳變異及是否存在準性生殖現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本試驗于2016年8月至2017年1月完成于河北農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯病害研究中心。

1.1 供試菌株

在筆者所在實驗室的菌庫中選取6株茄鏈格孢菌株，分別是采集自河北省的HB-1、HB-6，黑龍江省的HLJ-1、HLJ-9，內(nèi)蒙古自治區(qū)的NMG-1和陜西省的SX-1。

1.2 單孢分離和繼代培養(yǎng)

對6株野生型茄鏈格孢進行產(chǎn)孢培養(yǎng)并進行單孢分離。產(chǎn)孢培養(yǎng)參照劉麗麗的培養(yǎng)方法[9]進行誘導產(chǎn)孢;采用稀釋法進行單孢分離，向每皿經(jīng)誘導產(chǎn)孢的茄鏈格孢中加入5 mL無菌水進行沖洗，制備成孢子懸浮液，在一次性皿中倒入較薄的一層馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，取1 mL稀釋過的孢子懸浮液涂于皿中，靜待一段時間，待培養(yǎng)基表面無流動液體時，在顯微鏡下將周圍無菌絲的單個分生孢子連帶培養(yǎng)基一起切割轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得下一代菌株。

1.3 茄鏈格孢繼代培養(yǎng)菌株生長量的測定

每個菌株分離10株單孢，培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算其平均值。

1.4 茄鏈格孢繼代培養(yǎng)菌株單位面積產(chǎn)孢量的測定

菌株進行產(chǎn)孢培養(yǎng)3 d后，用5 mL無菌水在菌落上反復沖洗，使孢子脫落至無菌水中。將孢子懸浮液收集至10 mL離心管中，統(tǒng)計10倍物鏡視野下分生孢子的總數(shù)量。每次觀察并記錄5個視野下的孢子總數(shù)，計算其平均值。每個菌株至少檢測3皿長勢一致的菌落，取其平均值。

單位面積產(chǎn)孢量=每皿的產(chǎn)孢量/每皿的菌落面積。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

利用SPSS 19軟件對茄鏈格孢在繼代培養(yǎng)中的菌株菌落直徑和單位面積產(chǎn)孢量進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢菌落形態(tài)的影響

由圖1可知，茄鏈格孢在繼代培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了扇形、半月形和不規(guī)則形等角突變現(xiàn)象。6株親代菌株在平板培養(yǎng)時有2株發(fā)生了角突變現(xiàn)象;每個親代菌株分別分離到10株F1代菌株，在60株F1單孢后代中共有14株出現(xiàn)了角突變現(xiàn)象，其角突變率為23.33%;通過單孢分離獲得的40株F2代菌株中共有21株出現(xiàn)了角突變現(xiàn)象，其角突變率為52.50%。這表明茄鏈格孢單孢后代隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，其角突變率呈上升趨勢。

2.2 茄鏈格孢繼代培養(yǎng)菌株菌落顏色與產(chǎn)孢量的相關(guān)性

由表1可知，茄鏈格孢繼代培養(yǎng)后代菌落形態(tài)與顏色深淺變化明顯，且與其單位面積產(chǎn)孢量密切相關(guān)，顏色深的單位面積產(chǎn)孢量大，且發(fā)生半月形角變的菌株產(chǎn)孢量明顯高于未角變菌株（表中未列出）。其中，在HB-6的F1代10株菌株中，菌落顏色深的4株菌株為F1-1、F1-2、F1-3、F1-4，其單位面積產(chǎn)孢量為108～151個/mm2，菌落顏色淺的6株菌株F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10單位面積產(chǎn)孢量在1～4個/mm2之間，對菌株HB-6的F1代菌株單位面積產(chǎn)孢量進行方差分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1-1～F1-4菌株間只有F1-3菌株與F1-4菌株差異顯著，其余菌株之間差異不顯著，F(xiàn)1-5～F1-10菌株間差異也不顯著，但F1-1～F1-4菌株與F1-5～F1-10菌株間差異顯著。

2.3 單孢繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢菌株生長的影響

由表2可知，通過十字交叉法測定6株茄鏈格孢的親代菌株以及F1、F2代菌株的菌落直徑發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)菌株的菌落直徑呈逐代下降趨勢。與親代菌株相比，F(xiàn)1代菌落直徑下降1.25%～7.61%，F(xiàn)2代菌株直徑下降10.07%～22.29%。其中HLJ-1菌株菌落直徑差異最大，與親代菌株相比，F(xiàn)2代菌落直徑下降了22.29%;菌株HB-1下降趨勢較緩，F(xiàn)1代菌落直徑較親代下降了3.56%，與F1代相比，F(xiàn)2代菌落直徑下降6.76%。對6株茄鏈格孢的親代菌株以及F1、F2代菌株菌落直徑進行方差分析發(fā)現(xiàn)，除菌株NMG-1的親代和F1代菌落直徑間差異不顯著外，其余菌株的親代、F1代、F2代間差異均顯著。結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)使菌絲生長速度變慢，相同培養(yǎng)條件下親代、F1代、F2代的菌落直徑呈明顯的遞減趨勢，繼代培養(yǎng)抑制了菌絲的生長。

2.4 單孢繼代培養(yǎng)對茄鏈格孢產(chǎn)孢能力的影響

由圖2可知，4株茄鏈格孢菌株隨著繼代培養(yǎng)，其單位面積產(chǎn)孢量呈下降趨勢，且每個菌株的親代、F1代、F2代之間產(chǎn)孢量差異均顯著。與親代菌株相比，F(xiàn)1代菌株單位面積產(chǎn)孢

量降低12.80%～84.60%。其中，菌株NMG-1的F1代菌株的單位面積產(chǎn)孢量較其余菌株F1代產(chǎn)孢量高，為 27個/mm2，其余菌株產(chǎn)孢量為4～10個/mm2。F2代菌株中，各菌株單位面積產(chǎn)孢量較親代下降80.11%～96.50%，菌株HLJ-9的F2代菌株單位面積產(chǎn)孢量最低。說明隨著繼代培養(yǎng)，茄鏈格孢的產(chǎn)孢能力在不斷下降。

3 結(jié)論與討論

繼代培養(yǎng)往往會引起微生物菌落形態(tài)、顏色、生長和產(chǎn)孢等方面的變化，Rajanikanth等報道，繼代培養(yǎng)對白僵菌產(chǎn)孢量的影響很大[10];唐曉慶等研究發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)會使菌落發(fā)生變化[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)可以降低茄鏈格孢的生長速度，同時引起其產(chǎn)孢能力的退化。這與劉海英等關(guān)于玉米大斑病菌單孢繼代培養(yǎng)的研究結(jié)果[3]相符合。

真菌中關(guān)于角突變現(xiàn)象的報道已有多個，例如蟬擬青霉菌[11]、禾谷鐮刀菌[12]、黃瓜黑星病菌[13]和球孢白僵菌等，徐雍皋等提出，角變現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與不正常的細胞核分裂有關(guān)[12]。胡海燕等認為，角變現(xiàn)象是異核體分離造成的[14]，而唐曉慶等則認為，可能是核內(nèi)和核外遺傳物質(zhì)共同起作用的結(jié)果[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，茄鏈格孢菌在實驗室條件下培養(yǎng)會出現(xiàn)角變現(xiàn)象，F(xiàn)1、F2代菌株出現(xiàn)角變現(xiàn)象的概率分別為 23.33%、52.50%，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，整體呈上升趨勢，這與徐金柱等關(guān)于球孢白僵菌角變現(xiàn)象的研究結(jié)果[16]相符合。

本研究發(fā)現(xiàn)，茄鏈格孢菌落顏色與產(chǎn)孢量密切相關(guān)，菌落顏色深的菌株產(chǎn)孢量顯著高于菌落顏色淺的菌株。該結(jié)果與張倩倩等關(guān)于蕓薹生鏈格孢突變體與野生株相比菌落顏色變淺的研究結(jié)果[17]相一致。Lee等通過研究推測單個分生孢子在繼代培養(yǎng)過程中可能丟失染色體，茄鏈格孢單孢繼代培養(yǎng)性狀的改變可能與該菌染色體丟失引起的變異有關(guān)[18]。

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