人參內(nèi)生菌B69菌株抑菌物質(zhì)特性的研究

林星辰　田義新　王澤　牛林飛

摘要：研究人參內(nèi)生細(xì)菌B69菌株對(duì)人參根腐病病原菌的作用機(jī)制，通過硫酸銨沉淀、低溫乙醇沉淀等方法獲得菌株發(fā)酵液中活性成分，對(duì)其抑菌物質(zhì)粗提液進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定，并對(duì)其抑菌成分進(jìn)行分離，采用平板擴(kuò)散法測(cè)定提取成分的抑菌活性。結(jié)果表明，從B69菌株發(fā)酵液得到的提取液具有抑菌活性;對(duì)抑菌物質(zhì)粗提物進(jìn)行高溫、酸堿度、紫外線、反復(fù)凍融和蛋白酶K處理，抑菌活性均未見明顯變化。從B69發(fā)酵液中初步分離出具有抑制根腐菌活性的活性肽和胞外多糖。表明B69菌株能產(chǎn)生多種抑菌活性成分，抑菌成分對(duì)脅迫條件不敏感，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：人參;內(nèi)生細(xì)菌;B69菌株;人參根腐病;抑菌物質(zhì)

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）09-0167-04

人參（Panax ginseng C. A. Meyer）屬五加科多年生草本植物，是傳統(tǒng)的名貴中藥材。在我國(guó)東北地區(qū)已經(jīng)形成規(guī)模化種植[1]。人參病害一直是影響人參質(zhì)量最主要的因素之一，其中人參根腐病是常見的人參土傳病害，人參根腐病主要侵染人參的根部，造成根部軟化腐爛，危害嚴(yán)重且防治相當(dāng)困難[2]。在人參栽培中根腐病發(fā)病率最高可達(dá)50%，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

內(nèi)生細(xì)菌在宿主植物中具有豐富的多樣性，在與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過程中形成了特殊的共生關(guān)系[4-5]。因此人參內(nèi)生菌資源的開發(fā)用于人參病害的生物防治，對(duì)環(huán)境保護(hù)和人參質(zhì)量的提高都有巨大意義。目前人參內(nèi)生菌的報(bào)道多集中在內(nèi)生菌分離和次生代謝產(chǎn)物的研究上，對(duì)植物病害的防治報(bào)道較少，人參內(nèi)生菌這一重要的資源有待于開發(fā)。姜云等分離得到的人參內(nèi)生菌對(duì)人參根腐病病菌（Fusarium solani）等多種人參病原真菌具有明顯的抑制作用[6]。本試驗(yàn)通過對(duì)人參內(nèi)生細(xì)菌B69菌株分泌液中代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離提取，以期明確B69菌株合成的抑菌活性成分組成情況及其抑菌活性的穩(wěn)定性，為人參的病害防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株B69由筆者所在課題組從人參根中分離得到，經(jīng)劉學(xué)周等鑒定為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）[7]?；钚灾甘揪〔【杉洲r(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試細(xì)菌的保存和培養(yǎng)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基;供試細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)使用營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基;病原真菌分離培養(yǎng)使用馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗(yàn)時(shí)間地點(diǎn) 菌株抑菌物質(zhì)特性試驗(yàn)于2017年4—7月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 抑菌物質(zhì)粗提物的制備及抑菌活性測(cè)定

B69菌株的發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心 20 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到抑菌物質(zhì)粗提液，備用。抑菌活性用平板擴(kuò)散法測(cè)定。

1.3 抑菌物質(zhì)粗提物穩(wěn)定性的測(cè)定

溫度、pH值、蛋白酶、紫外線、反復(fù)凍融等穩(wěn)定性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 有機(jī)溶劑萃取物制備及其抑菌活性

取4支試管加抑菌物質(zhì)粗提液，向其中分別加入等體積的有機(jī)溶劑（三氯甲烷、乙醚、乙酸乙醚、丙酮）進(jìn)行萃取。待萃取液分層后，將水相與有機(jī)相進(jìn)行分離，水相部分經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾。分別測(cè)定水相和有機(jī)相提取液的抑菌活性，以有機(jī)溶劑為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。72 h后測(cè)定其對(duì)根腐病病菌的抑菌圈大小。

1.5 抑菌蛋白成分的提取及其抑菌活性檢驗(yàn)

1.5.1 硫酸銨沉淀法 在抑菌物質(zhì)粗提液中加入硫酸銨，使其最終飽和濃度分別達(dá)到30%、40%、50%、60%、70%、80%，混勻，于4 ℃靜置24 h。以飽和濃度為80%的培養(yǎng)液作為對(duì)照。在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀溶于緩沖液中，測(cè)定沉淀和上清液的抑菌活性。

1.5.2 低溫乙醇沉淀法 將無水乙醇提前放入冰箱進(jìn)行預(yù)冷處理。在0 ℃冰浴中向抑菌物質(zhì)粗提液中緩慢加入乙醇使其在溶液中的終濃度分別為50%、60%、70%、80%。于 4 ℃ 靜置6 h以上，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，分別收集沉淀和上清液，將沉淀溶于磷酸鹽（PBS）緩沖液中，所得沉淀即為蛋白粗提液。測(cè)定上清液和沉淀的抑菌活性，以濃度為80%的乙醇培養(yǎng)液作同樣的處理為對(duì)照。取乙醇上清液和沉淀溶解液各1.5 mL，在4 ℃水浴中加熱20 min后，測(cè)定抑菌活性。

1.6 脂肽粗提取物的制備及其抑菌活性檢驗(yàn)

取10 mL NA發(fā)酵上清液，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，4 ℃靜置12 h，10 000 r/min離心20 min。所得上清液用NaOH調(diào)節(jié)pH值為中性后4 ℃保存?zhèn)溆?。將沉淀用甲醇溶解，抽濾3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，所得干燥樣品用PBS緩沖液（0.02 mol/L，pH值為7.2）定容至10 mL，經(jīng)0. 22 μm濾膜除菌，即得脂肽粗提物。檢測(cè)脂肽粗提液和上清液的抑菌活性，以發(fā)酵上清液為陽性對(duì)照，以無菌PBS緩沖液為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 胞外多糖的提取及測(cè)定

1.7.1 提取過程 將B69菌株發(fā)酵液稀釋3倍，在 10 000 r/min 條件下離心10 min，棄菌體，收集離心液。以Sevag法去除蛋白質(zhì)[9]，處理過程如下：由正丁醇和三氯甲烷以1 ∶4的體積比配制Sevag液，將其按4 ∶1的體積比加入離心液中，振蕩25 min，6 000 r/min離心10 min，棄沉淀，反復(fù)處理3次，得到去除蛋白的離心液。向離心液中加乙醇來沉淀多糖，以空白培養(yǎng)液作同樣處理為對(duì)照。用BaCl2溶液檢測(cè)是否將SO42-徹底去除，用碘-碘化鉀反應(yīng)檢測(cè)是否將培養(yǎng)基中的淀粉徹底去除。

本試驗(yàn)對(duì)人參內(nèi)生菌B69菌株抑菌物質(zhì)的特性進(jìn)行了研究。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，人參內(nèi)生菌B69菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)粗提液耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿、對(duì)蛋白酶不敏感，紫外線照射和反復(fù)凍融對(duì)其活性沒有明顯影響。該菌株分泌的胞外抑菌物質(zhì)可以被乙醇部分沉淀，但不能被硫酸銨沉淀。抑菌物質(zhì)提取液經(jīng)100 ℃處理后，部分失活，乙醇處理后的上清液耐高溫。沉淀經(jīng)100 ℃處理20 min后失活。從B69菌株中得到的粗脂肽提取物具有抑菌活性并且其胞外多糖也具有抑制根腐病病菌的作用，因此目前可知該植株可以至少產(chǎn)生2種抑菌物質(zhì)。

本試驗(yàn)中得到的多肽具有抑菌活性，近年來，微生物來源的多肽被用于抗真菌病害方面的研究也有很大的進(jìn)展，它與化學(xué)農(nóng)藥相比污染少、對(duì)環(huán)境友好，在農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，在植物保護(hù)領(lǐng)域，多糖被用來誘導(dǎo)植物的抗性防衛(wèi)反應(yīng)，如誘導(dǎo)過氧化物酶和幾丁質(zhì)酶的積累，提高植物的抗病能力，或者直接抑制植物病原菌[15]，多糖研究正越來越多地引起人們關(guān)注[16]。本試驗(yàn)從B69菌株中提取出的胞外多糖能夠抑制根腐病病菌的生長(zhǎng)，極具研究?jī)r(jià)值。

本試驗(yàn)在對(duì)B69菌株開展抑菌活性研究的基礎(chǔ)上，就其次生代謝產(chǎn)物中的抑菌活性成分也開展了初步研究，基本明確了抑菌活性物質(zhì)的活性部位，這為菌株抑菌活性物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抑菌機(jī)制研究奠定了良好基礎(chǔ);另外，上述試驗(yàn)結(jié)果的獲得也將有助于推動(dòng)人參病害的生物防治。

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