MyD88在綿羊肺炎支原體感染過程中的作用

張俊波　印雙紅　易萌　陸安法

摘要：為分析MyD88在綿羊肺炎支原體（MO）感染肺泡上皮細胞中的分子機制。用不同濃度的抑制劑ST2825與細胞孵育24 h，用MTT法檢測細胞活性;MO感染細胞后，于4、8、12、24 h收集細胞，利用實時定量PCR檢測MyD88 mRNA的表達水平。采用不同濃度的MyD88抑制劑ST2825與細胞孵育1 h，然后用MO感染細胞，于24 h收集細胞，利用實時定量PCR檢測白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）mRNA的表達水平，用試劑盒檢測caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2濃度、NO濃度和LDH濃度變化。結(jié)果顯示，MO于4、8、12、24 h顯著提高細胞MyD88 mRNA表達水平;MO顯著提高細胞IL-8 mRNA水平、TNF-α mRNA水平、caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2濃度、NO濃度和LDH濃度（P<0.01），而ST2825（濃度為10 μmol/L和20 μmol/L）能夠顯著降低MO介導的以上指標（P<0.05），表明MyD88在MO感染肺泡上皮細胞過程中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：綿羊肺炎支原體;MyD88;致病機制

中圖分類號：S858.26 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0197-04

山羊傳染性胸膜肺炎是山羊的一種急性或慢性呼吸道傳染病，主要癥狀為纖維素性胸膜肺炎，此病可感染各種年齡的公母羊群，有很高的發(fā)病率和死亡率，被世界動物衛(wèi)生組織列入通報疫病名錄，我國將此病列為二類傳染病[l-4]。此病的臨床特征為：高熱、卡他性鼻液、眼結(jié)膜炎、纖維素性胸膜炎、母羊流產(chǎn)、消瘦等等。該病在世界范圍內(nèi)普遍流行，嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。山羊傳染性胸膜肺炎在我國流行時間較長，最早在甘肅發(fā)現(xiàn)有此病發(fā)生，隨后，在多個省份報道此病發(fā)生，例如在內(nèi)蒙古、四川、云南、江蘇等地[5]。在貴州的流行情況，2001年首次獲得絲狀支原體山羊亞種分離株[6]，2011年首次獲得綿羊肺炎支原體分離株[7]。貴州白山羊的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)位于銅仁市沿河縣，在山羊疾病中傳染性胸膜肺炎發(fā)病率和死亡率高，年齡在2歲內(nèi)的山羊較易感染，發(fā)病率為37.7%，病死率為36.4%[8]。此病已嚴重危害貴州養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。

TLRs是一類天然免疫受體，是高度保守的I型跨膜蛋白，為模式識別受體，是關鍵的天然免疫分子[9]，主要在免疫細胞和上皮細胞上表達。它通過識別病原微生物的保守結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用，激活天然免疫細胞，導致一系列的機體炎癥反應，在機體抵御病原微生物侵襲上發(fā)揮重要作用。TLR樣受體信號通路介導多種生物學效應，如誘導炎癥因子釋放，誘導殺菌活性，促凋亡與抗凋亡作用等。MyD88是TLR信號通路中的關鍵接頭蛋白，在傳遞上游信息和感染疾病發(fā)生中至關重要。MyD88與心血管疾病、炎癥性腸病、腫瘤等疾病密切相關。

目前，由于MO對山羊肺泡上皮細胞的作用機制尚不是很清楚，本試驗以探討MyD88在MO感染山羊肺泡上皮細胞中作用機制為目的，發(fā)現(xiàn)MyD88在MO對山羊肺泡上皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用，該研究為MO的致病機制研究提供理論基礎和參考意見。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 支原體與細胞

綿羊肺炎支原體與山羊肺泡上皮細胞于2015年10月在銅仁市沿河縣康源白山羊生態(tài)養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社采集，然后將其保存于梵凈山特色動植物資源重點實驗室。

1.1.2 試劑

胎牛血清和DMEM細胞培養(yǎng)液，購自GIBCO公司;酵母提取物、蛋白胨，購自上海生工公司;Triton X-100細胞裂解液、MTT試劑盒和DMSO，購自北京索萊寶科技有限公司;caspase-3活性檢測試劑盒和ST2825抑制劑，購自Apexbio公司;LDH試劑盒，購自南京建成生物工程研宄所;SYBR染料，購于羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗

收集對數(shù)期的山羊肺泡上皮細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔103～104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積為200 μL，邊緣孔用無菌的PBS填充。棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度，具體操作見說明書。

1.2.2 細胞處理

（1）MyD88 mRNA檢測組：將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng)，當單層細胞生長至80%覆蓋度時，更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液，支原體 ∶細胞按10 ∶1的比例感染細胞，在5% CO2、37 ℃環(huán)境中孵育。于4、8、12、24 h 4個時間點收集細胞;（2）TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、Caspase-3活性、Caspase-8活性、H2O2濃度、NO濃度及LDH濃度檢測組：將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng)，當單層細胞生長至80%覆蓋度時，更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液，將抑制劑不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h，然后，支原體 ∶細胞按 10 ∶1 的比例感染細胞，在5% CO2、37 ℃環(huán)境中孵育，于 24 h 收集細胞。

1.2.3 實時定量PCR檢測MyD88、TNF-α、IL-8 mRNA

MyD88 mRNA實時定量PCR檢測細胞樣品包括4、8、12、 24 h 4個時間點支原體感染組細胞及PBS對照組細胞。

TNF-α、IL-8 mRNA實時定量PCR檢測細胞樣品包括24 h一個時間點支原體感染組細胞、支原體-抑制劑ST2825（5 μmol/L）組細胞、支原體-抑制劑ST2825（10 μmol/L）組細胞、支原體-抑制劑ST2825（20 μmol/L）組細胞及PBS對照組細胞。

從NCBI網(wǎng)站GenBank查找MyD88、TNF-α、IL-8和 β-actin公布的基因序列，采用Primer 5.0軟件設計對特異性引物（表1），引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

用Trizol一步法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。內(nèi)參β-actin為對照，在羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行相對定量的PCR反應，反應體系為：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水6 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 15 s，60 ℃ （MyD88、IL-8）或61 ℃（TNF-α、β-actin） 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每組細胞每個時間點的細胞做3個重復，樣本基因MyD88、TNF-α、IL-8的表達強度用其對應的β-actin的量進行校正，即ΔCt=Ct（MyD88、TNF-α、IL-8）-CT（β-actin），相對表達量用2-ΔΔCT法對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.4 Caspase-3與Caspase-8活性檢測

取細胞上清液，4 ℃，12 000 r/min離心8 min，按照試劑盒說明書檢測 Caspase-3和Caspase-8活性。

1.2.5 H2O2濃度的測定

把H2O2檢測試劑在冰上融解，在檢測孔加入50 μL樣品或標準品。在每個孔內(nèi)加入 100 μL H2O2檢測試劑。輕輕振蕩混勻，室溫放置30 min，然后立即測定D560 nm。計算出樣品中H2O2的濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 NO濃度的測定

取細胞上清液，4 ℃，12 000 r/min離心7 min，按照說明書檢測NO濃度。

1.2.7 LDH實驗

取50 μL細胞上清液測LDH的D450 nm，按照說明書進行操作。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x[TX-*5]±s）描述，多組樣本間均數(shù)用方差分析，2組間比較采用2個樣本均數(shù)的t參數(shù)檢驗或q檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制劑ST2825對肺泡上皮細胞活性的影響

不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）抑制劑ST2825與細胞作用24 h后，收集細胞，利用MTT方法檢測細胞活性，結(jié)果表明，當抑制劑ST2825濃度為5、10、20 μmol/L不影響細胞活性（圖1），可進行后續(xù)研究。

2.2 對不同時間下MO感染肺泡上皮細胞的分析

MO感染肺泡上皮細胞（MOI為10）后，提取細胞的總RNA，用實時定量PCR檢測MyD88的mRNA水平。感染時間為4、8、12、24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所觀察的時間點可以顯著提高MyD88 mRNA表達水平（圖2）。

2.3 抑制劑ST2825對MO介導的H2O2分泌影響

將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h，用MO感染細胞，在24 h檢測胞內(nèi)MO對細胞引起的損傷情況，結(jié)果（圖3）顯示，MO可顯著提高H2O2分泌（P<0.01），抑制劑ST2825在 10 μmol/L 和20 μmol/L濃度下可以顯著降低MO介導的H2O2分泌（P<0.05），表明ST2825可以降低MO引起的細胞損傷。

2.4 ST2825對MO介導的caspase-3和caspase-8活性的影響

進一步檢測ST2825對MO介導的caspase-3和 caspase-8活性的影響，將不同濃度ST2825與細胞提前孵育1 h，再用MO感染細胞24 h，檢測caspase-3和caspase-8的活性。結(jié)果顯示，MO可極顯著提高caspase-3（圖4-A）和caspase-8（圖4-B）的活性（P<0.01），而ST2825在濃度 10 μmol/L 和20 μmol/L時能夠顯著降低MO介導的 caspase-3（圖4-A）和caspase-8（圖4-B）的活性（P<0.05）。

2.5 ST2825對MO介導的TNF-α與IL-8 mRNA表達的影響

由圖5可知，將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h，用MO感染細胞，在24 h檢測胞內(nèi)MO對細胞TNF-α與 IL-8 mRNA的影響發(fā)現(xiàn)，MO感染細胞組TNF-α（圖5-A）與IL-8（圖5-B）mRNA表達水平極顯著高于對照組（P<0.01），ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L濃度下可顯著降低MO介導的TNF-α（圖5-A）與IL-8 mRNA（圖5-B）表達水平（P<0.05），表明ST2825可以降低MO引起的炎癥因子 TNF-α與IL-8 mRNA的表達。

2.6 ST2825對MO介導的NO的影響

將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h，然后，用MO感染細胞，在24 h檢測胞內(nèi)MO對細胞引起的損傷情況顯示，MO感染細胞組NO水平極顯著高于對照組（P<0.01），而抑制劑ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L濃度下可以顯著降低MO介導的NO分泌（P<0.05），NO是一個非常關鍵的信號分子，在細胞凋亡過程中起重要作用，結(jié)果表明抑制劑ST2825可以降低MO引起的凋亡相關基因NO的表達（圖6）。

2.7 ST2825對MO介導的LDH的影響

由圖7可知，將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h，用MO感染細胞，在24 h檢測培養(yǎng)液上清液中LDH水平，結(jié)果顯示，MO感染細胞組LDH水平極顯著高于對照組（P<0.01），而抑制劑ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L濃度下可以顯著降低MO介導的LDH（P<0.05）。結(jié)果表明，MO可引起肺上皮細胞崩解，ST2825可以降低MO引起的細胞崩解度。

3 討論

TLRs屬于一種模式識別受體，可識別病原體的相關分子

模式，識別的范圍很廣，主要包括脂質(zhì)類、碳水化合物和脂蛋白等結(jié)構(gòu)，是連接非特異性免疫和特異性免疫應答的一個橋梁[10]。TLR4是TLRs其中的成員，它是通過活化前炎癥事件的一系列信號對病原生物所進行的應答，而脂多糖是TLR4配體有效的激動劑[11]。當被感染肺炎支原體后，就會激起宿主體內(nèi)的免疫應答[12]，而天然免疫系統(tǒng)又是宿主抵御病原入侵的第一道防線，其中TLR在其中發(fā)揮著主要作用。支原體可激活宿主細胞Toll樣受體（TLR）信號通路，致使細胞釋放大量的TNF-α和IL-1等因子的釋放[13]。本研究表明，在抑制劑ST2825的作用下，可以抑制支原體介導的TNF-α mRNA表達水平。

MyD88依賴性途徑是所有的TLR配體所介導的一個關鍵通路，而MyD88非依賴性途徑是TLR3和TLR4專有的信號傳導途徑的通路。MyD88與TLRs相互作用后，募集IRAK家族蛋白。但在外源刺激下由配體激活后，IRAK-4發(fā)揮致IRAK-1磷酸化的激酶作用，磷酸化的IRAK-1繼而與MyD88作用。此時，MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域與受體發(fā)生結(jié)合，N端的DD結(jié)構(gòu)域與TRAF6、IRAK-1和IRAK-4復合體共同結(jié)合至受體上。而IRAK-1和TRAF-6發(fā)生磷酸化反應活化后與MyD88發(fā)生解離反應。

caspases家族存在于絕大多數(shù)哺乳類細胞中，其中caspase-3與caspase-8在caspase級聯(lián)反應中作用至關重要，是導致細胞凋亡的關鍵途徑和所有凋亡信號傳導的共同通路[14-15]。caspase-8是細胞凋亡步驟中的起始因子，可以直接活化下游效應分子caspase-3。而caspase-3位于細胞凋亡級聯(lián)反應的下游，也是細胞程序性死亡的關鍵因子[16]。本試驗結(jié)果顯示，MO可顯著提高caspase-3的活性，而ST2825能夠顯著降低caspase-3的活性，消弱MO對 caspase-3活性的促進作用。

不同濃度下的NO存在促進細胞凋亡和抑制細胞凋亡雙重作用。己有研究發(fā)現(xiàn)支原體不僅介導宿主發(fā)生免疫反應，同時也可引起單核細胞和巨噬細胞壞死或凋亡發(fā)生[17]。細胞凋亡是通過級聯(lián)反應與細胞因子變化致細胞死亡的過程。NO作為參與宿主各種生理和病理過程的多功能因子，低濃度的NO，可保護細胞免受凋亡，但NO的分泌過多可導致多種類型細胞發(fā)生凋亡。此外，多種支原體能夠通過分泌過量NO來誘導細胞凋亡[18-19]。而NO的表達是由低劑量抑制因子一氧化氮合酶（NOS）所控制的[20]，過量的NO與超氧陰離子自由基形成過氧亞硝酸鹽，從而活化細胞凋亡的級聯(lián)反應[21]。

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