熊健　屈燕　冷秋思　趙琬玥

摘要：為建立適合綠絨蒿屬（Meconopsis Vig.）的SSR反應(yīng)體系，以多刺綠絨蒿（M. horridula）為試材，應(yīng)用L25（56）進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)影響SSR-PCR的主要因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mg2+對(duì)PCR反應(yīng)效果影響最大，而dNTPs的影響最小。5個(gè)因素水平的變化對(duì)綠絨蒿屬SSR-PCR反應(yīng)體系的影響從大到小依次為Mg2+>Taq酶含量>引物濃度>DNA模板量>dNTPs濃度。適宜綠絨蒿屬的SSR反應(yīng)體系：總體積25 μL，Mg2+濃度2 mmol/L，dNTPs濃度 0.2 mmol/L，引物濃度 0.5 μmol/L，DNA模板量60 ng，Taq聚合酶量 1.6 U，其余用ddH2O補(bǔ)充。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 1.5 min;94 ℃ 20 s，最適退火溫度20 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃ ?5 min;4 ℃ 保存。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對(duì)同屬另外8種綠絨蒿（M. wallichi、M. racemosa、M. lingholm、M. prattii、M. rudis、M. napaulensis Pinky、M. paniculata、M. superba）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得優(yōu)良的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，該試驗(yàn)建立的反應(yīng)體系適用于綠絨蒿屬植物的 SSR-PCR 反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：綠絨蒿;SSR;PCR體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q949.95文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0060-04

綠絨蒿是罌粟科（Papaveraceae）綠絨蒿屬（Meconopsis）植物的總稱，有“高山牡丹”之稱。綠絨蒿是一年或多年生草本，花大而美麗，顏色豐富，有藍(lán)色、紫色、紅色、黃色，稀白色。全世界共有49種，1種產(chǎn)自西歐，其余48種均分布于東亞的喜馬拉雅地區(qū)，但最原始種恰在華中[1]。我國(guó)有38種，集中分布于西南部。綠絨蒿不僅花色艷麗，具有很高的觀賞價(jià)值，是著名的觀賞植物，同時(shí)還是傳統(tǒng)藏醫(yī)藥用植物，有清熱解毒、利尿、消炎、止痛等功效[2]。作為潛力巨大的藥用觀賞植物，目前綠絨蒿屬大多數(shù)物種已處于瀕危狀態(tài)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱SSR）又稱微衛(wèi)星DNA，是以1～6個(gè)堿基為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、高信息量、共顯性、檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)。SSR分子標(biāo)記是目前最為常用的微衛(wèi)星標(biāo)記之一[3]。目前，在國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)于綠絨蒿屬植物SSR-PCR反應(yīng)體系的研究成果。本研究以多刺綠絨蒿為試材，通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、DNA模板量、Taq聚合酶量等5個(gè)主要因素進(jìn)行探索優(yōu)化，篩選出各因素的最適量，建立和優(yōu)化綠絨蒿 SSR-PCR 的反應(yīng)體系，為綠絨蒿屬的遺傳多樣性研究提供技術(shù)支持和參考[4]。

1材料與方法

所有試驗(yàn)均于2017年12月20日至25日在西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1材料

試驗(yàn)以多刺綠絨蒿（M. horridula）為試材及SSR引物P23進(jìn)行反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立和優(yōu)化反應(yīng)體系，并選取M. wallichi、M. racemosa、M. lingholm、M. prattii、M. rudis、M. napaulensis Pinky、M. paniculata、M. superba等8種綠絨蒿DNA以及SSR引物P2、P10、P29進(jìn)行反應(yīng)體系的驗(yàn)證。試驗(yàn)中所用到的SSR引物由筆者所在課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)，并由昆明碩擎生物科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2生物試劑

SSR-PCR反應(yīng)體系中的10×PCR Buffer（含Mg2+）、dNTPs、Taq聚合酶、DNA maker、Loading Buffer購(gòu)自綠誠(chéng)生物技術(shù)有限公司。

1.3基因組DNA的提取與檢測(cè)

利用試劑盒法提取9種樣品（表2）試驗(yàn)所需綠絨蒿DNA，通過(guò)微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和純度，篩選出D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間的優(yōu)質(zhì)DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，選出各樣品中質(zhì)量最佳的[JP3]DNA各1份，稀釋至20 ng/μL，置于-70 ℃保存?zhèn)溆茫▓D1）。

1.4SSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以M. horridula為試材，利用引物P23進(jìn)行正交試驗(yàn)。優(yōu)化SSR-PCR的正交試驗(yàn)以L25（56）正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)，以5因素（Mg2+、dNTPs、引物濃度、DNA模板量、Taq聚合酶量）的5個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，共25個(gè)組合（表3）。PCR擴(kuò)增體系為 25 μL體系，除了添加表3內(nèi)的各種反應(yīng)液外，需添加ddH2O進(jìn)行補(bǔ)充。試驗(yàn)進(jìn)行2次重復(fù)。

1.5PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

PCR反應(yīng)在BIOMETRA TProfessional standard梯度PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為25 μL體系。反應(yīng)組合共25個(gè)，在退火溫度設(shè)置為60 ℃下進(jìn)行1次PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表4。

擴(kuò)增產(chǎn)物取2 μL加入4 μL Loading Buffer，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠通過(guò)BioSpectvum AC Chemi HR 410凝膠成像儀進(jìn)行成像觀察并保存膠圖。

1.6統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

參照何正文等的方法[5]，根據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度、彌散程度以及特異性對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，最高記10分（條帶清晰，彌散程度弱，特異性高），最低記1分。利用SPSS 17.0軟件對(duì)2次重復(fù)試驗(yàn)的評(píng)分值總數(shù)進(jìn)行方差分析。

1.7最佳SSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證