有機磷水解酶對不同有機磷農藥降解功效的評價

高熳熳　白俊巖　孫磊　程書梅　霍書英

摘要：通過2種檢測方法測定了有機磷水解酶對不同有機磷農藥的降解功效，一種方法是通過氣相色譜法直接檢測降解產物中農藥的殘留量來評價有機磷水解酶對不同農藥的降解功效;另一種方法是利用有機磷類農藥可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，受抑制的膽堿酯酶不能將靛酚乙酸酯（紅色）分解為靛酚（藍色）和乙酸的原理，通過測定有機磷水解酶降解后有機磷農藥的殘留量對膽堿酯酶的抑制作用來評價有機磷水解酶對不同有機磷農藥的降解功效。研究結果發(fā)現(xiàn)：有機磷水解酶對甲基對硫磷、對硫磷、喹硫磷和敵敵畏具有高效降解作用，降解率在82.2%～98.7%;其次是氧樂果、久效磷和敵百蟲，降解效率在28.1%～45.4%;其他的降解效率均在20%以下。

關鍵詞：有機磷水解酶;有機磷農藥;膽堿酯酶;降解功效

中圖分類號： S481+.8;X592文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0217-03

20世紀90年代，我國有機磷類農藥的年產量曾達到 300 000 t，目前，雖然一些毒性大的有機磷農藥已被禁用，但一些低毒的有機磷農藥仍在使用[1]，并且除了作為殺蟲劑之外擴展到殺菌劑、殺鼠劑、除草劑、脫葉劑和植物生長調節(jié)劑等方面使用。因有機磷農藥具有藥效高、品種多、防治范圍廣、成本低等特點，因此一些禁用的有機磷農藥還在偷偷生產使用，并且常因使用、保管不當有機磷農藥中毒事件也時有發(fā)生[2]。有機磷類農藥對農產品、大氣、土壤、水源等具有極大的污染[3-4]，其對環(huán)境和人類的危害，已成為事關人類健康和國民經濟發(fā)展的重大問題。因此有機磷農藥降解酶的研制是消除和解毒農藥殘留的一種安全、有效的方法[5]，具有無毒、無殘留、無二次污染等優(yōu)點。

有機磷水解酶（OPH）被公認為最具有應用前景的有機磷降解酶，目前由中國農業(yè)科學院自主研發(fā)的“有機磷農藥降解酶制劑”已廣泛投入生產使用，比如“比亞蔬菜瓜果農藥降解酶”、馬蒂爾“蔬菜瓜果農藥降解酶”“綠芯農藥降解酶”等農藥降解產品已在農業(yè)生產上大量應用;但目前并沒有統(tǒng)一的國家標準來評價這些酶制劑降解底物的范圍，對底物的降解效果如何。本試驗研究了有機磷水解酶對不同有機磷農藥的降解功效，并通過氣相色譜法和膽堿酯酶抑制法2種檢測方法測定了有機磷水解酶對不同有機磷農藥的降解功效，并對2種檢測方法進行了比較。

1材料與方法

1.1試劑與材料

甲基對硫磷（CAS：298-00-0）、敵敵畏（CAS：62-73-7）、氧樂果（CAS：1113-02-6）、甲胺磷（CAS：10265-92-6）、甲拌磷（CAS：298-02-2）、內吸磷（CAS：8065-48-3）、對硫磷（CAS：56-38-2）、敵百蟲（CAS：52-68-6）、喹硫磷（CAS：1776-83-6）、殺撲磷（CAS：950-37-8）、三唑磷（CAS：24017-47-8）、久效磷（CAS：6923-22-4），純度均≥99%，購自德國Merck公司;丙酮、乙腈、氯化鈉（色譜純）;磷酸鹽緩沖液（分析純）;95%乙醇;膽堿酯酶、靛酚乙酸酯，購自Solarbio;有機磷水解酶（OPH），由北京森根比亞生物技術有限公司提供[酶活性≥11 μmol/（min·mg）]。

1.2儀器與設備

恒溫水浴鍋（HH-W600，金壇市朗博儀器制造有限公司）;酶標儀（美國伯樂，Bio-rad）;氣相色譜儀（帶氮磷檢測器，備有毛細管柱，美國Thermo TRACE GC ULTRA）;旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52A）;氮吹儀（上海育模儀器有限公司，YMDCY-12S）;真空泵（上海育模儀器有限公司，YDP-02）;高速離心機（上海安亭，LXJ-IIB）;分析天平（上海儀電分析儀器有限公司，PHS-3DW）。

1.3有機磷水解酶對有機磷農藥降解功效的氣相色譜法測定

1.3.1有機磷農藥濃度-峰面積標準曲線的繪制用 100 mg/L 農藥標準品分別配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL不同濃度的丙酮溶液，氣相色譜測定峰面積，繪制峰面積-濃度的標準曲線，并確定不同農藥的出峰時間。

1.3.2氣相色譜條件

型號為Thermo TRACE GC ULTRA;色譜柱為石英毛細管柱，DB-1701，30 m×0.53 mm（內徑）×1.0 μm（膜厚）;載氣為氮氣（純度大于99.999%）;載氣流速10 mL/min，尾吹氣流速為30 mL/min;氫氣流速為 75 mL/min，空氣流速為100 mL/min;柱溫為初始溫度150 ℃保持1 min，以 20 ℃/min 升至270 ℃，保持15 min;進樣口溫度為250 ℃;檢測器溫度為250 ℃;進樣方式為不分流進樣;進樣量為1 μL;開閥時間為1.5 min。

1.3.3有機磷水解酶對不同有機磷農藥的降解率測定取10 mL 1 μg/mL的不同農藥工作液，加入5 mL ?pH值為8.0的1 mg/mL有機磷水解酶，對照組加入等量的磷酸鹽緩沖液，置于生化培養(yǎng)箱中進行反應，溫度控制在37 ℃，反應10 min，然后取出迅速加入30 mL乙腈萃取降解反應殘留的農藥底物，顛倒混勻，加入5 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min 離心5 min，乙腈相取出10 mL，相當于樣品量的1/3，移人 50 mL 旋轉蒸發(fā)瓶中，先用旋轉蒸發(fā)器濃縮至1 mL，在室溫下用氮吹儀濃縮至近干，用丙酮定容1 mL，供氣相色譜測定，計算出酶降解后農藥的殘留量，然后計算有機磷水解酶的降解率。

有機磷水解酶對有機磷農藥降解率的計算公式：

R=X-X0X×100%。

式中：R為生物制品的降解效率;X為反應體系中降解反應前標準農藥的濃度;X0為反應體系中降解反應結束后殘留農藥的濃度。

1.4有機磷水解酶降解率的酶抑制法測定

1.4.1膽堿酯酶抑制率曲線的建立在試管中加入470 μL不同濃度的有機磷農藥（對照管加等量pH值為7.0的 50 mmol/L 磷酸緩沖液）、10 μL 的200 U/g乙酰膽堿酯酶，混勻，于37 ℃水浴中反應10 min，加入20 μL靛酚乙酸酯，混勻，37 ℃反應5 min，加入500 μL 95%乙醇終止反應，使用酶標儀在605 nm處測定吸光度[6]。計算酶的抑制率，以農藥濃度的對數(shù)值為橫坐標、抑制率為縱坐標作出標準曲線。抑制率的計算公式為：

I=（U0-U1）/U0×100%。

式中：U0為未受抑制的酶活性;U1為受農藥抑制的酶活性。

1.4.2有機磷水解酶降解率的測定取470 μL不同濃度1.5、2.5、5 μg/mL有機磷農藥加入有機磷水解酶至終濃度為 1 000 mg/L，對照組加入等量的磷酸鹽緩沖液，37 ℃反應 20 min，沸水中加熱5 min終止反應，然后用酶抑制法測定有機磷水解酶降解產物中農藥的殘留量。

1.4.3計算方法有機磷農藥可以抑制乙酰膽堿酯酶活性，受抑制的膽堿酯酶不能將靛酚乙酸酯（紅色）分解為靛酚（藍色）和乙酸，根據(jù)“1.4.1”節(jié)的膽堿酯酶的抑制率與農藥濃度的對數(shù)值標準曲線查找與抑制率對應的農藥濃度的對數(shù)值，計算出有機磷水解酶降解產物中農藥的殘留量，然后再根據(jù)“1.3.3”節(jié)有機磷水解酶降解率的計算公式計算有機磷水解酶的降解率。

2結果與分析

2.1氣相色譜法檢測農藥降解結果

由表1可知，有機磷水解酶對有機磷農藥降解率比較高的是甲基對硫磷、對硫磷、喹硫磷和敵敵畏，降解率在82.2%～98.7%之間;其次是氧樂果、久效磷和敵百蟲 （28.1%～45.4%）;其他的降解率均在20%以下，同時各個農藥回收率范圍為75%～105%。

2.2有機磷水解酶對不同農藥降解率的酶抑制法測定

2.2.1敵敵畏的抑制率曲線和有機磷水解酶的降解率由圖1可見，以敵敵畏濃度的對數(shù)值為橫坐標，膽堿酯酶抑制率為縱坐標，繪制標準曲線， 二者呈線性關系，r2=0.990 6。通過抑制率曲線計算得出有機磷水解酶對3種濃度敵敵畏的降解率均達到90%以上（表2），說明該酶對敵敵畏具有較好的降解效果。

2.2.2敵百蟲的抑制率曲線和有機磷水解酶的降解率由圖2可見，以敵百蟲濃度的對數(shù)值為橫坐標，膽堿酯酶抑制率為縱坐標，繪制標準曲線，二者呈線性關系，r2=0.992。通過抑制率曲線計算得出有機磷水解酶對3種濃度敵百蟲降解率平均值在58%左右（表3），說明該酶對敵百蟲降解效果一般。

2.2.3甲基對硫磷抑制率曲線和酶降解率測定結果由圖3可見，以甲基對硫磷濃度的對數(shù)值為橫坐標，膽堿酯酶抑制率為縱坐標，繪制標準曲線，二者呈線性關系，r2=0.992 5。通過抑制率曲線計算得出有機磷水解酶對3種濃度甲基對硫磷的降解率均達到98%以上（表4），說明該酶對甲基對硫磷的降解效果較好，同時也說明該酶抑制法能夠方便準確地測定該酶的降解效率。

3討論與結論

我國是一個農業(yè)大國，農藥的使用可以降低病蟲害，因此農藥的使用在我國非常普遍[7]，每年施用80萬～100萬t的化學農藥[8]，其中殺蟲劑占農藥總數(shù)的75%，而在殺蟲劑中，有機磷殺蟲劑占所有殺蟲劑的75%[9-10]。相關數(shù)據(jù)顯示，我國的農產品中農藥殘留現(xiàn)象非常嚴重，為了降低農藥殘留和農殘毒性的危害，目前農藥降解酶制劑產品的生產和使用也越來越多，但市場上銷售的有機磷水解酶制劑產品并不標注其農藥降解范圍和降解率，并且時?？浯笃渥饔眯Ч壳拔覈€沒有出臺正式的國家標準對農藥降解酶制劑產品進行規(guī)范檢測和監(jiān)督，參照國家標準農藥殘留的檢測方法（GB/T 5009.20—2003《食品中有機磷農藥殘留量的測定》），筆者建立了有機磷水解酶對農藥降解功效的氣相色譜測定方法。筆者通過氣相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)有機磷水解酶（OPH）對甲基對硫磷、對硫磷、喹硫磷和敵敵畏降解效果非常好，降解率在82.2%～98.7%，尤其是對甲基對硫磷降解率甚至可達99%;其次是對氧樂果、久效磷和敵百蟲降解率偏低，降解率在28.1%～45.4%;對其他有機磷農藥降解率則更低，一般都在20%以下。

氣相色譜法（GC）具有靈敏、準確等優(yōu)點，它的柱效高、分離能力強、靈敏度高，主要用于低分子量、易揮發(fā)有機化合物的分析，目前80%的農藥殘留檢測采用GC，定性和定量測定結果準確可靠、靈敏度高[11]。筆者建立的農藥降解酶的降解率的氣相色譜測定法適用于多種酶制劑對不同農藥底物降解率的測定，但也存在操作步驟繁多、農藥回收率不穩(wěn)定、對儀器和技術條件要求高、在實際應用中不易廣泛推廣使用等缺點。

為了建立一種操作簡便、便于掌握、在實踐中易推廣應用的農藥降解酶對農藥降解率的測定方法，筆者參照農藥殘留的酶抑制測定法（GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測》）加以改進建立了有機磷水解酶降解功效的膽堿酯酶抑制測定法。通過該測定方法檢測的有機磷水解酶對敵敵畏降解率在92%以上，對敵百蟲的降解率在54%～65%之間，對甲基對硫磷的降解率在98%以上。有機磷水解酶對敵敵畏和甲基對硫磷的降解功效與氣相色譜法測定結果一致，但對敵百蟲降解功效的測定結果偏高，這可能是因為不同有機磷農藥對膽堿酯酶活性的抑制作用不同，有研究發(fā)現(xiàn)21種有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶抑制作用較強的是敵敵畏;其次是毒死蜱、甲胺磷、殺撲磷、速滅磷及內吸磷;較弱的為樂果、久效磷、異稻瘟凈、馬拉硫磷及乙拌磷[12]。因此該方法適用于對膽堿酯酶活性抑制作用較強的有機磷農藥降解率的測定，所以該方法雖然操作方法簡單，便于掌握但有一定的局限性。

通過氣相色譜法和酶抑制法的結果顯示，有機磷水解酶對有機磷農藥確實有一定降解效果，其中對于甲基對硫磷的降解效果最好，對其他有機磷農藥也有一定的降解效果。這為以后研發(fā)固定化酶來降解有機磷農藥殘留提供了理論依據(jù)。通過采用酶來處理農藥及其殘留物，不僅可以降低直接使用微生物菌種對環(huán)境造成的風險和危害，還可以利用酶比微生物本身的耐受性強、能夠在更惡劣的環(huán)境中存活的優(yōu)點，對農藥殘留物進行降解。固化酶對環(huán)境條件的忍受能力較強，常用于對農藥的降解和污染物處理。有機磷水解酶降解有機磷農藥的殘留物效果較好[13]，因此須要加強對其穩(wěn)定性和固定化技術的研究，從而更好地利用它來降解農藥殘留物。另外在生產實踐中根據(jù)實際情況選擇有機磷水解酶降解率的測定方法，加強對市場有機磷水解酶制劑產品的檢測和監(jiān)管，對于規(guī)范市場、保證農產品的質量、維護人類健康具有重要的意義。

參考文獻：

[1]寧詩琦. 土壤中殘留有機磷農藥的環(huán)境行為及生物修復研究進展[J]. 安徽農學通報，2017，23（8）：93-95.

[2]付廣云，韓長秀. 有機磷農藥及其危害[J]. 化學教育，2005（1）：9-10.

[3]王賽妮，李蘊成. 我國農藥使用現(xiàn)狀、影響及對策[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2007（20）：3853-3855.

[4]劉穎. 我國農藥使用現(xiàn)狀、原因及對策研究[J]. 國土與自然資源研究，2005（4）：50-51.

[5]虞云龍，樊德方，陳鶴鑫. 農藥微生物降解的研究現(xiàn)狀與繁殖策略.[J]環(huán)境科學進展，1996，4（3）：28-36.

[6]羅永偵. 產有機磷農藥降解酶菌株的篩選及酶學性質研究[D]. 南寧：廣西大學，2007：15.

[7]王政. 發(fā)酵食品中有機磷農藥的微生物降解研究[D]. 湖北工業(yè)大學，2017：1.

[8]周春梅. “入世”與中國農產品農藥殘留的應對措施[J]. 農業(yè)與技術，2001，21（6）：7-10.

[9]崔洪力，李強，劉美良. 農藥殘留及監(jiān)控對策[J]. 農業(yè)與技術，2002，22（5）：74-76.

[10]王文嬌，張濤，陳健美，等. 韭菜農藥殘留現(xiàn)狀及防控技術[J]. 山東農業(yè)科學，2011（10）：82-84.

[11]張苗苗，王素雅. 農產品中農藥檢測殘留及消解研究進展[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2016，10（4）：15-18.

[12]顏冬云，蔣新，余貴芬，等. 有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶活性的聯(lián)合抑制作用[J]. 科技與開發(fā)，2006，45（1）：31-34.

[13]王靜巖，傅營，王斌. 微生物降解農藥研究[J]. 北京農業(yè)，2015（8）：6.