響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花化學(xué)成分提取工藝的研究

崔莉　趙恒強　耿巖玲　王志偉　王曉　閆慧嬌

摘要：為了確定牡丹花化學(xué)成分提取的最佳工藝條件，從化學(xué)成分的穩(wěn)定性和操作的便捷性考慮，用超聲法對牡丹花的提取工藝進(jìn)行研究。以液相色譜圖中14個共有峰的總峰面積為指標(biāo)，分別考察超聲提取時間、乙醇濃度、液料比對牡丹花多種化學(xué)成分共同提取效果的影響，用響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花的超聲提取工藝。結(jié)果表明，乙醇濃度對牡丹花提取效果的影響最大，其次是液料比與超聲時間，用響應(yīng)面法優(yōu)化得到牡丹花超聲提取的最適工藝條件如下：乙醇濃度為 60.92%，液料比為86.21 mL ∶1 g，超聲時間為24.34 min。通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)，在此最佳提取條件下，色譜圖中共有峰峰面積的總和與預(yù)測值相近，可見通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的牡丹花化學(xué)成分提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞：牡丹花;提取工藝;超聲法;響應(yīng)面法;Box-Behnken設(shè)計

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0212-05

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為毛茛科芍藥屬灌木，有“富貴花”和“花中之王”的美稱，是中華民族傳統(tǒng)文化的重要組成部分，享有“國花”的盛譽[1]。牡丹花在我國有悠久的藥用和食用歷史，《四川中藥志》中記載：牡丹花性平、苦、淡，具有調(diào)經(jīng)活血的功能，主治月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)[2]。明代的《遵生八菚》中曾記載：“牡丹新落花瓣亦可煎食”。清代的《養(yǎng)小錄》中記載：“牡丹花瓣，湯淖可，蜜浸可，肉汁燴亦可”，2013年，丹鳳牡丹花被中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會（現(xiàn)為中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會）批準(zhǔn)為新食品原料[3]，是我國寶貴的天然植物資源。然而，在傳統(tǒng)的牡丹產(chǎn)業(yè)中，牡丹花常被當(dāng)作廢棄物丟棄，造成巨大的浪費。

牡丹花中的活性成分種類較多，含量豐富，現(xiàn)代研究證明，這些成分具有活血、殺菌、抗氧化等多種活性[4-7]。在前期研究中，筆者對牡丹花的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離，發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物主要包括黃酮類、沒食子酸類、鞣質(zhì)類及其芍藥苷類單萜苷類化合物[8-11]。而目前有關(guān)牡丹花化學(xué)成分提取的研究多針對黃酮類，且以總黃酮提取率作為方法優(yōu)劣的判斷標(biāo)準(zhǔn)[12-15]，無法為全面表征牡丹花的生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)，從而從整體上評價牡丹花的質(zhì)量提供參考。響應(yīng)面設(shè)計（response surface methodology，簡稱RSM）是一種有效的統(tǒng)計和優(yōu)化方法，在試驗條件優(yōu)化的過程中可以連續(xù)地對試驗因素的各個水平進(jìn)行分析，并能給出直觀的圖形[16-21]。筆者在前期對牡丹花的化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，對其主要化學(xué)成分進(jìn)行了辨認(rèn)，并以液相色譜中的共有峰（包括黃酮類、沒食子酸、鞣質(zhì)類、芍藥苷）的總峰面積為響應(yīng)值，運用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計，對牡丹花提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬為牡丹花資源的綜合開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與材料

Agilent 1120型高效液相色譜儀[配有二極管陣列（DAD）檢測器、自動進(jìn)樣器，美國Agilent公司];KQ3200超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;JJ1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）。

牡丹花采自山東菏澤，于2017年4月采收新鮮丹鳳牡丹的花瓣，于50 ℃熱風(fēng)烘干，粉碎過40目篩，在山東省分析測試中心實驗室的干燥器內(nèi)避光保存。主要試劑如下：乙醇，分析純，購自德州恒業(yè)化工有限公司;甲醇、乙腈，色譜純，購自山東禹王試劑有限公司;甲酸，色譜純，購自德國Riedel公司;其余試劑均為分析純。試驗用水為超純水。對照品芍藥苷、野漆樹苷、紫云英苷，購自中國食品藥品檢定研究院;1-O-galloyl-β-D-glucopyranose（1-O-沒食子?；?β-D葡萄糖）、1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose（1，2，3，4，6-O-五沒食子?；?β-D葡萄糖）、kaempferol-3，7-di-O-β-D-glucopyranoside（山柰酚-3，7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、沒食子酸、沒食子酸甲酯、大波斯菊苷、二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、氧化芍藥苷由筆者所在實驗室分離、純化后，經(jīng)核磁、質(zhì)譜、紅外、紫外鑒定，純度均達(dá)99%（相對純度）以上。

1.2試驗方法

1.2.1對照品溶液的制備分別取適量1-O-沒食子?；?β-D葡萄糖、沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-O-五沒食子?；?β-D葡萄糖、野漆樹苷、紫云英苷、大波斯菊苷這11種對照品，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為45.5、45.2、60.0、25.3、25.4、60.0、720.0、61.0、101.0、60.0、81.2 mg/L的混合對照品溶液。

1.2.2液相色譜條件采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC），色譜柱采用Micro C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。以0.1%甲酸 （A）- 乙腈（B）溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫：0～5 min，5% B;5～8 min，5%～12% B;8～23 min，12% B;23～24 min，12%～15% B;24～30 min，15% B;30～31 min，15%～21% B;31～38 min，21% B;38～39 min，21%～22% B;39～48 min，22% B;48～53 min，22%～34% B;53～63 min，34% B;63～64 min，34%～90% B;64～69 min，90% B;流量為 1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為270 nm。

1.2.3牡丹花瓣提取方法的選擇精確稱取10份牡丹花瓣粉末，每份0.50 g，置于具塞錐形瓶中，各加入50 mL溶劑，稱定質(zhì)量，其中5份樣品分別用50%乙醇于65 ℃浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，另外5份樣品分別用50%乙醇超聲提取5、10、30、50、70 min。提取后靜置至室溫，稱量并補足至提取前的質(zhì)量，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，按照“1.2.2”節(jié)的方法進(jìn)樣檢測。

1.2.4牡丹花瓣超聲提取法的工藝流程精確稱取10份牡丹花瓣粉末，每份0.50 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL不同濃度的乙醇，稱質(zhì)量，超聲提?。?50 W，40 kHz），冷卻至室溫，稱量并補足至提取前的質(zhì)量，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

1.2.5牡丹花瓣超聲提取工藝參數(shù)的單因素試驗分別考察不同超聲提取時間（10、20、30、40、50 min）、乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）和液料比（20 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、100 mL ∶1 g、200 mL ∶1 g、500 mL ∶1 g）對牡丹花瓣提取效率的影響。

1.2.6響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花超聲提取工藝試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定液料比、乙醇濃度和超聲時間3個因素的水平，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。具體試驗因素與各水平設(shè)計見表1。

2結(jié)果與分析

2.1牡丹花化學(xué)成分的分析

在前期對牡丹花化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離的基礎(chǔ)上，通過與對照品進(jìn)行高效液相色譜比對，對其化學(xué)成分進(jìn)行了分析，共確定14個共有峰中的11個成分，圖1中的1號峰為1-O-galloyl-β-D-glucopyranose，2號峰為沒食子酸，3號峰為氧化芍藥苷，4號峰為沒食子酸甲酯，5號峰為二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，6號峰為kaempferol-3，7-di-O-β-D-glucopyranoside，7號峰為芍藥苷，9號峰為1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose，11號峰為野漆樹苷，12號峰為紫云英苷，13號峰為大波斯菊苷。

2.2牡丹花瓣化學(xué)成分提取方法的選擇

選擇色譜圖中信噪比（S/N）>30的14個共有峰作為評價指標(biāo)，以50%乙醇超聲處理20 min的單位樣品峰面積為1，計算不同處理方法下樣品的共有峰峰面積提取率，并進(jìn)行比較。從圖2可以看出，不同提取方法對各共有峰的峰面積影響不明顯，超聲法提取率稍高于溫浸法，9號峰的峰面積提取率在20 min、1 h最高，但是隨著提取時間的延長，提取率反而下降，而1、2號峰則相反。通過與對照品圖譜對應(yīng)保留時間（圖1-a）的對比可初步推測，1號峰為1-O-galloyl-β-D-glucopyranose，2號峰為沒食子酸，9號峰為1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose，可能由于提取時間的延長，部分沒食子酰鞣質(zhì)發(fā)生水解，生成沒食子酸或沒食子酰基葡萄糖。從總體上看，超聲法用時較短，考慮到操作的便捷性，選擇超聲法作為牡丹花化學(xué)成分的提取方法。

2.3牡丹花瓣超聲提取工藝參數(shù)的單因素試驗

2.3.1液料比對提取效果的影響固定超聲時間為20 min，乙醇濃度為60%，選擇液料比20 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、100 mL ∶1 g、200 mL ∶1 g、500 mL ∶1 g進(jìn)行試驗。以色譜圖中S/N>30的14個共有峰總峰面積為評價指標(biāo)，由圖3-a可以看出， 隨著液料比的增加，共有峰的總峰面積逐漸增加，當(dāng)液料比大于100 mL ∶1 g時，共有峰的總峰面積增勢變緩，提取趨于完全，考慮到成本及后處理，選擇100 mL ∶1 g作為較優(yōu)的液料比。

考慮到在提取過程中會發(fā)生部分沒食子酰鞣質(zhì)水解生成沒食子酸或沒食子?；咸烟堑姆磻?yīng)，這幾種成分的含量變化可反映不同參數(shù)條件對牡丹花化學(xué)成分提取效果的綜合影響，因此同時選擇1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose（9號峰）、沒食子酸（2號峰）的峰面積比值（峰9/峰2）作為評價指標(biāo)，進(jìn)一步考察單因素試驗的提取效果。圖3-b結(jié)果顯示，液料比對兩峰比值有一定的影響，隨著液料比的增加，兩峰面積比值逐漸提高，當(dāng)液料比大于 100 mL ∶1 g 時，兩峰面積比值逐漸降低。

2.3.2乙醇濃度對提取效果的影響固定液料比為 100 mL ∶1 g，超聲時間為20 min，選擇20%、40%、6%、80%、100%的乙醇濃度對牡丹花進(jìn)行提取試驗。以色譜圖中S/N>30的14個共有峰總峰面積為評價指標(biāo)，由圖4-a可以看出，當(dāng)乙醇濃度為60%時，共有峰的總峰面積達(dá)到峰值;當(dāng)乙醇濃度為80%時，提取效果又有所減弱。因此，選擇60%為最優(yōu)乙醇濃度。從9號峰、2號峰的峰面積比值來看，使用不同比例的溶劑提取時，對兩者的提取效率不同，當(dāng)乙醇濃度為80%時，化合物9、化合物2的峰面積比值最大（圖4-b），推測是由于2種化合物的極性不同造成的。

2.3.3超聲提取時間對提取效果的影響固定液料比為100 mL ∶1 g，乙醇濃度為60%，選擇超聲時間為10、20、30、40、50 min 進(jìn)行試驗。以色譜圖中S/N>30的14個共有峰總峰面積為評價指標(biāo)，由圖5-a可以看出，超聲20 min后，總峰面積趨于平穩(wěn)，基本實現(xiàn)了提取完全，50 min時則略有下降，可能由于超聲時間過長，導(dǎo)致提取溫度升高，牡丹花內(nèi)的部分化學(xué)成分發(fā)生了降解。由圖5-b可以看出，9號峰、2號峰的峰面積比值呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，超聲提取20 min后，隨著提取時間的延長，峰面積比值下降，部分沒食子酰鞣質(zhì)發(fā)生水解，生成沒食子酸或沒食子?；咸烟恰楦玫乇３帜档せɑ瘜W(xué)成分的穩(wěn)定，同時節(jié)約能源，選擇20 min為最優(yōu)超聲時間。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花化學(xué)成分的超聲提取工藝試驗

根據(jù)Box-Behnken的組合設(shè)計原理，用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平共15個試驗，中心點重復(fù)3次試驗，以色譜圖中S/N>30的14個共有峰的總峰面積為響應(yīng)值（R），具體試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2。

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的綜合評價數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程：R=14 138.40+105.25[KG*3]×[KG*3]A+[KG*3]243.13[KG*9]×B+22.63×C-5.75×AB+13.75×AC+2.50×BC-84.45×A2-1 296.20×B2-36.20×C2。由表3的回歸模型方差分析結(jié)果可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對提取效果有極顯著影響。本試驗?zāi)Ｐ偷腜<0.01，說明響應(yīng)面的模型顯著性較高，而失擬誤差項的P>0.05，說明響應(yīng)面模型對試驗擬合的情況較好，試驗誤差較小，可以很好地對牡丹花超聲提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測。

響應(yīng)面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖6可以看出，乙醇濃度對牡丹花提取效果的影響最大，其次是液料比，超聲時間對牡丹花提取效果的影響最小。液料比與超聲時間的交互作用對牡丹花提取效果的影響較大，其次為液料比與乙醇濃度的交互作用，乙醇濃度與超聲時間的交互作用影響最不明顯。

2.5驗證試驗

用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化得到牡丹花超聲提取的最佳工藝如下：液料比為86.21 mL ∶1 g，乙醇濃度為 60.92%，超聲時間為24.34 min，在此條件下總共有峰面積的預(yù)測值為14 189。為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，對模型[CM（25]優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗證。考慮到試驗的可行性與便捷性，選擇液料比86 mL ∶1 g、乙醇濃度61%、超聲時間24 min進(jìn)行3次試驗。由表4的驗證結(jié)果可以看出，方程與真實試驗情況擬合得較好，優(yōu)化的工藝可靠、可行。

3結(jié)論與討論

由于響應(yīng)面法是在單因素試驗的基礎(chǔ)上得到相應(yīng)的點，并從這些點中獲得1個完整、連續(xù)的面，再在此面中獲得最優(yōu)值。因此，在響應(yīng)面整體設(shè)計中，單因素試驗中變量參數(shù)的選擇顯得格外關(guān)鍵。本研究先通過單因素試驗選取提取時間、乙醇濃度、液料比3個工藝變量合適的參數(shù)水平。由于牡丹花中含有的芍藥苷等單萜苷類化合物及一些易水解的鞣質(zhì)類化合物對溫度較為敏感，在高溫下穩(wěn)定性較差，不宜使用高溫浸提，與本試驗中提取方法初篩的結(jié)果相一致，并且超聲法具有提取效率高、操作簡單、節(jié)能等優(yōu)點，可作為較優(yōu)的牡丹花提取方法。

本研究使用3因素3水平的響應(yīng)面分析法對牡丹花超聲提取工藝的提取時間、乙醇濃度、液料比進(jìn)行考察，獲得的最佳提取工藝條件為乙醇濃度60.92%、液料比86.21 mL ∶1 g、超聲時間24.34 min，并通過驗證試驗證明了該條件參數(shù)的可行性，在該條件下，牡丹花化學(xué)成分的提取更為全面、充分，可用于牡丹花質(zhì)量的綜合評價，并可為牡丹的綜合利用、開發(fā)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]任崇勇，程德海. 菏澤牡丹資源開發(fā)利用現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（22）：316-322.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典（上冊）[M]. 上海：上海人民出版社，1977：1130.

[3]國家衛(wèi)生計生委. 關(guān)于批準(zhǔn)祼藻等8種新食品原料的公告 （2013年第10號）[Z]. （2013-11-26）[2017-10-11]. http：//www.nhfpc.gov.cn/sps/s7890/201311/533ed8492dd04ff3a a63c7e7dd40c256.shtml.

[4]Huang W S，Mao S Q，Zhang L Q，et al. Phenolic compounds，antioxidant potential and antiproliferative potential of 10 common edible flowers from China assessed using a simulated in vitro digestion-dialysis process combined with cellular assays[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2017，97（14）：4760-4769.

[5]Zhang H F，Li X F，Wu K，et al. Antioxidant activities and chemical constituents of flavonoids from the flower of Paeonia ostii[J]. Molecules，2017，22（1）：5-20.

[6]Li C H，Du H，Wang L S，et al. Flavonoid composition and antioxidant activity of tree peony （Paeonia section Moutan） yellow flowers[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（18）：8496-8503.

[7]Ogawa K，Nakamura S，Sugimoto S，et al. Constituents of flowers of Paeoniaceae plants，Paeonia suffruticosa and Paeonia lactiflora[J]. Phytochemistry Letters，2015，12：98-104.

[8]史國安，郭香鳳，包滿珠. 不同類型牡丹花的營養(yǎng)成分及體外抗氧化活性分析[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2006，37（8）：111-114.

[9]閆慧嬌，趙偉，耿巖玲，等. 牡丹花化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（12）：2056-2059.

[10]趙偉，耿巖玲，崔莉，等. 牡丹花黃酮類化學(xué)成分研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2016，18（3）：303-306.

[11]閆慧嬌，王志偉，陳燕平，等. 鳳丹牡丹花瓣化學(xué)成分研究[J]. 山東科學(xué)，2017，30（3）：12-16.

[12]高燕，楊品珍，馬銀海. 超聲波提取紅牡丹色素的工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2014（5）：41-43.

[13]王曉，江婷，程傳格，等. 超聲波強化提取牡丹花黃酮[J]. 山東科學(xué)，2004，17（3）：13-16.

[14]王曉，耿巖玲，李福偉，等. 酶法提取牡丹花總黃酮[J]. 山東科學(xué)，2005，18（4）：14-17.

[15]袁亞光，王成忠，饒鴻雁. 牡丹花中黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J]. 山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，27（4）：31-34，38.

[16]Khajeh M. Response surface modelling of lead pre-concentration from food samples by miniaturised homogenous liquid-liquid solvent extraction：Box-Behnken design[J]. Food Chemistry，2011，129（4）：1832-1838.

[17]Maran J P，Manikandan S，Priya B，et al. Box-Behnken design based multi-response analysis and optimization of supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid compounds from tea （Camellia sinensis L.） leaves[J]. Journal of Food Science and Technology - Mysore，2015，52（1）：92-104.

[18]Zhang J J，Wei Y L，Li H Z，et al. Application of Box-Behnken design to optimize multi-sorbent solid phase extraction for trace neonicotinoids in water containing high level of matrix substances[J]. Talanta，2017，170：392-398.

[19]金林，趙萬順，郭巧生，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化白芍提取工藝的研究[J]. 中國中藥雜志，2015，40（15）：2988-2993.

[20]王正寬，石曉朦，劉圓，等. Box-Behnken法中試規(guī)模下優(yōu)化小青龍顆粒超聲提取工藝[J]. 中國中藥雜志，2016，41（4）：683-688.

[21]侯學(xué)敏，李林霞，張直峰，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)，2013，34（6）：124-128.