和文志 潘鵬舉 楊玲

摘要：為進(jìn)一步明確鐵線蓮屬16個(gè)園藝品種之間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，利用12條ISSR引物對(duì)16份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得117條清晰的條帶，多態(tài)性條帶占比為97.44%。利用引物UBC815和UBC817構(gòu)建16個(gè)鐵線蓮品種的指紋圖譜，可以有效地對(duì)鐵線蓮進(jìn)行區(qū)分和鑒定。利用NTSYS軟件計(jì)算出鐵線蓮品種間的遺傳相似系數(shù)為 0.20～0.73，平均相似系數(shù)為0.51。通過UPGMA法進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為0.53時(shí)，可將16份材料劃分為4大類。結(jié)果表明，鐵線蓮品種之間的遺傳關(guān)系較為復(fù)雜，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以從分子水平揭示16份材料的遺傳多樣性水平和親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：鐵線蓮;品種;ISSR;遺傳多樣性;指紋圖譜

中圖分類號(hào)： Q756;S682.390.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0079-04

鐵線蓮為毛茛科（Ranunculaceae）鐵線蓮屬（Clematis L.）植物，現(xiàn)已知的鐵線蓮約有300種，廣泛分布于世界各地。我國(guó)約有133種，主要分布在華中和西南地區(qū)[1]。鐵線蓮具有非常高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值。該屬植物不僅花型多樣，有平盤形、十字形、鐘形、長(zhǎng)瓣形等，還兼具花期長(zhǎng)、色彩豐富的特點(diǎn)，擁有“藤本皇后”的美譽(yù)。在園藝家和植物學(xué)家?guī)装倌甑脑耘嗪陀N過程中，培育出了上千個(gè)各具特色的鐵線蓮園藝品種[2]。這些品種中，絕大部分都是由多個(gè)不同的種雜交而來，還有部分品種是由野生種馴化而來[3]。長(zhǎng)時(shí)間的人工選擇過程中，鐵線蓮品種的遺傳背景和各品種之間的親緣關(guān)系變得模糊不清，有些雜交品種已經(jīng)找不到最初的雜交親本，這給雜交育種親本選擇帶來一定的困難。同時(shí)，鐵線蓮很多品種外觀形態(tài)相似度高，導(dǎo)致鐵線蓮品種鑒定越來越難。由于受環(huán)境影響因素較大，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法難以對(duì)鐵線蓮品種進(jìn)行有效區(qū)分。因此，運(yùn)用分子生物學(xué)手段對(duì)鐵線蓮品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，可為鐵線蓮品種在分子水平的分類與鑒定提供依據(jù)。目前，在有關(guān)鐵線蓮品種遺傳多樣性研究上，前人多從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)[4-7]等方面開展了一些研究，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道較少。

簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好和多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因作圖與定位、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育等的研究。孫正海等建立了鐵線蓮ISSR-PCR的反應(yīng)體系，并且進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化和引物篩選，但未進(jìn)一步研究該分子標(biāo)記技術(shù)在鐵線蓮品種遺傳多樣性研究中的可行性與穩(wěn)定性[8-9]。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)從分子水平對(duì)鐵線蓮16個(gè)園藝品種遺傳多樣性進(jìn)行探究，為ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在鐵線蓮品種分類鑒定、親緣關(guān)系分析以及種質(zhì)資源利用和新品種培育過程中親本選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為2015年12月從國(guó)外引進(jìn)的16個(gè)鐵線蓮園藝品種。試驗(yàn)地為西南林業(yè)大學(xué)一號(hào)教學(xué)樓前苗圃，位于云南省昆明市盤龍區(qū)，屬于北亞熱帶低緯高原山地季風(fēng)氣候，年平均氣溫16.5 ℃，年均降水量1 450 mm，無霜期278 d。采集生長(zhǎng)良好的植物幼嫩葉片，置于放入硅膠的自封袋當(dāng)中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。品種信息（來自世界園藝鐵線蓮協(xié)會(huì)）詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 采用DNA提取試劑盒（OMEGA D2485-01）提取植物基因組DNA。利用Nanodrop ND-2000微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA鏈的完整性，電泳緩沖液為 0.5×TBE。

1.2.2 ISSR引物篩選與PCR擴(kuò)增 試驗(yàn)所選100條引物（UBC801～UBC900）由哥倫比亞大學(xué)公布，昆明碩擎生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括模板DNA，引物2 μL，12.5 μL PCR反應(yīng)混合物（Master Mix），加入雙蒸水使體系達(dá)到25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性90 s， 50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，43個(gè)循環(huán);72 ℃延伸

從上述100條引物中初步篩選出28條進(jìn)行退火溫度梯度的試驗(yàn)，篩選出條帶數(shù)量豐富、清晰穩(wěn)定的引物12條，并確定最適退火溫度。最后，利用這12條引物對(duì)16個(gè)鐵線蓮品種進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)記錄與分析 根據(jù)凝膠成像結(jié)果，同一引物擴(kuò)增出來的條帶，在同一遷移率上出現(xiàn)條帶記為“1”，丟失條帶記為“0”，建立0、1二元數(shù)據(jù)矩陣。選擇多態(tài)性位點(diǎn)比較豐富的引物，構(gòu)建16個(gè)鐵線蓮品種的指紋圖譜;利用NTSys2.1數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算品種間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，并采用UPGMA法構(gòu)建其遺傳聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵線蓮DNA提取效果

利用DNA提取試劑盒提取鐵線蓮16個(gè)品種的DNA都是一條完整清晰的譜帶（圖1），沒有RNA污染、拖尾和彌散現(xiàn)象，利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)得DNA的濃度為55～120 ng/μL。提取的DNA可以滿足ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求。

2.2 ISSR引物篩選及擴(kuò)增結(jié)果

從100條ISSR引物中篩選出12條擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定、數(shù)量豐富的引物，分別為UBC809、UBC810、UBC815、UBC821、UBC817、UBC826、UBC828、UBC830、UBC836、UBC856、UBC859、UBC888。通過退火溫度梯度（44.7～62.5 ℃）試驗(yàn)，確定了每條引物的最佳退火溫度。利用篩選出的引物對(duì)16個(gè)供試材料進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。12條引物共擴(kuò)增出117條帶，其中特異性條帶共有114條，每個(gè)引物平均擴(kuò)增出來9.75個(gè)位點(diǎn)，平均特異性位點(diǎn)達(dá)到9.5個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)到97.44%（表2）;擴(kuò)增出的條帶片段大小為250～1 500 bp。引物UBC817、UBC815和UBC856擴(kuò)增結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

x2.3 16個(gè)鐵線蓮園藝品種的ISSR聚類結(jié)果

利用12條引物擴(kuò)增出來的117譜帶建立16個(gè)鐵線蓮品

種的遺傳相似系數(shù)矩陣（表3），各品種之間的相似系數(shù)在 0.20～0.73之間，平均相似系數(shù)為0.51。說明鐵線蓮品種具有較高的遺傳多樣性，各品種間的遺傳變異較大，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)。其中，包查德女伯爵和紅衣主教相似系數(shù)最大，為0.73，這表明2個(gè)品種之間的親緣關(guān)系相對(duì)較近;塞西爾和邁克萊特相似系數(shù)最小，為0.20，表明這2個(gè)品種的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。從遺傳相似系數(shù)來看，塞西爾同其他品種之間的遺傳相似系數(shù)較小，為0.20～0.35，表明該品種與其他品種相比遺傳變異大、親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

采用UPGMA法對(duì)供試的16個(gè)鐵線蓮園藝品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，在相似系數(shù)為0.50處，可將16份材料聚為3類（圖5）。其中，塞西爾劃為A類，紫鈴鐺劃為B類，C類包括其余14個(gè)品種。在相似系數(shù)為0.53處，可將16份材料劃分為4個(gè)類群。塞西爾劃為第1類;紫鈴鐺劃為第2類;第3類包括月光、邁克萊特、格拉芙泰美女和普魯吐斯;其余10個(gè)品種劃為第4類。

2.4 16個(gè)鐵線蓮園藝品種的ISSR指紋圖譜構(gòu)建

利用擴(kuò)增出條帶清晰、條帶數(shù)量多、多態(tài)性豐富的引物構(gòu)建16個(gè)鐵線蓮品種的遺傳指紋圖譜。利用引物UBC815和UBC817構(gòu)建16個(gè)鐵線蓮品種的指紋圖譜（表4），該指紋圖譜可以有效地對(duì)這些鐵線蓮品種進(jìn)行區(qū)分、鑒定。

3 結(jié)論與討論

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出的12條引物擴(kuò)增出117個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性條帶的比例為97.44%，每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為6～15條，多態(tài)性條帶所占比例為88.89%～100%。其中12條引物中有9條引物擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性達(dá)到了100%，說明鐵線蓮栽培品種具有較高的遺傳多樣性和復(fù)雜的遺傳背景。利用引物UBC815和UBC817建立起的16個(gè)鐵線蓮品種的DNA指紋圖譜可以對(duì)不同品種進(jìn)行有效地區(qū)分和快速鑒定。對(duì)材料進(jìn)行ISSR聚類分析，在相似系數(shù)0.50處可將16份材料聚為3類。A類只有品種塞西爾;B類只有紫鈴鐺;C類有普魯吐斯、格拉芙泰美女、邁克萊特、月光、美佐世、天真一瞥、小鴨、鉆石球、艾米莉亞花盤、藍(lán)天使、包查德女伯爵、紅衣主教、面白和吉恩斯。其中，包查德女伯爵與紅衣主教之間的相似系數(shù)最大，為0.73，親緣關(guān)系最近，遺傳背景相似。從花朵形態(tài)特征來看，包查德女伯爵和紅衣主教除花朵顏色不同外，都具有相同數(shù)量苞片，花期都為6—9月，花型都是平盤型，萼片中部具有豎狀條紋，說明ISSR分子聚類與形態(tài)聚類在一定程度上的一致性。C類中鐵線蓮的花型都為平盤型，A類花型為長(zhǎng)瓣型，B類為鈴鐺型。以此來看，按照花型分類也可以將材料劃分為3類，這與ISSR聚類結(jié)果保持一致，擁有相同花型的品種之間可能具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系。但是在同一花型中，不同品種的花朵顏色、單重瓣及萼片數(shù)量等性狀表現(xiàn)不一，這可能是鐵線蓮品種之間相互雜交導(dǎo)致種質(zhì)資源混雜的結(jié)果，說明分子聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果存在一定的差異。塞西爾和邁克萊特之間的相似系數(shù)最小，為0.20，說明這2個(gè)品種之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在鐵線蓮新品種培育中，可以利用這2個(gè)品種進(jìn)行雜交，可能會(huì)產(chǎn)生較好的雜種優(yōu)勢(shì)。

按照栽培品種的生境特點(diǎn)、開花特性及開花時(shí)間等，園藝家將鐵線蓮品種劃為不同的品種類群。按照ISSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果將16份材料劃分的3大類群中，A類只有1個(gè)長(zhǎng)瓣型品種;B類只有1個(gè)單葉型品種;C類中包括8個(gè)早花大花型品種、1個(gè)德克薩斯型品種、2個(gè)意大利型品種和3個(gè)晚花大花型品種。ISSR聚類結(jié)果顯示，不同園藝類型的鐵線蓮品種劃分到同一類中，表明按照?qǐng)@藝性狀分類結(jié)果與分子標(biāo)記聚類結(jié)果存在一定的差異。這主要是因?yàn)閳@藝家對(duì)鐵線蓮品種的分類是為了園藝種植的考量，分類依據(jù)主要是植物生長(zhǎng)環(huán)境、適應(yīng)能力、花朵大小、顏色和開放時(shí)間等園藝特性。分子聚類與園藝分類的差異體現(xiàn)了鐵線蓮品種之間的遺傳變異程度之大，這是長(zhǎng)期人工選擇和自然進(jìn)化的共同作用的結(jié)果。ISSR聚類結(jié)果可以為鐵線蓮品種親緣關(guān)系鑒定和雜交育種中親本選擇提供參考。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相比，以遺傳物質(zhì)DNA為基礎(chǔ)的ISSR分子標(biāo)記重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，受環(huán)境因素影響小，在植物花卉種源信息鑒定、品種分類和遺傳多樣性評(píng)價(jià)等[10-12]方面具有廣泛的應(yīng)用。

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