解淀粉芽孢桿菌LZN01對西瓜?；图怄哏牭毒囊种菩?yīng)

史一然 徐偉慧 呂智航

摘要：西瓜?；图怄哏牭毒‵ON）是西瓜枯萎病的病原菌，生物防治是控制西瓜枯萎病的重要手段。研究解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑制效應(yīng)。試驗結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑菌率為57.07%;FON孢子懸液與解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液按體積比1 ∶ 1混合培養(yǎng)6、12、24 h，孢子萌發(fā)抑制率分別為86.21%、67.50%、56.04%，抑制率隨時間的增加呈下降趨勢;經(jīng)解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液處理，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)FON菌絲細胞膨大且畸變，菌絲表面嚴重受損;溫度在-20 ℃～60 ℃之間，pH值在4～9之間，解淀粉芽孢桿菌LZN01的發(fā)酵液抑菌效果穩(wěn)定;解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液抑菌能力穩(wěn)定。綜上所述，解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON具有較好的抑制能力，且抑菌效果穩(wěn)定，在西瓜枯萎病生物防治方面具有較大的開發(fā)和應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;抑制作用;孢子萌發(fā);發(fā)酵上清液;西瓜專化型尖孢鐮刀菌;生防菌劑

中圖分類號： S436.5? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0141-05

西瓜在世界園藝中占有重要比例，我國是西瓜生產(chǎn)和消費的第一大國，年種植面積為200萬hm2，年產(chǎn)量為7 000余萬t[1]。西瓜枯萎病是由西瓜專化型尖孢鐮刀菌（FON）引起的一種嚴重的世界性土傳維管束病害，是導(dǎo)致西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)降低（含糖量下降）最重要的因素之一，該病輕則導(dǎo)致西瓜減產(chǎn)10%～40%，重則減產(chǎn)可達80%以上甚至絕收，是造成西瓜經(jīng)濟損失最大的病害之一[2]。隨著西瓜種植面積的逐年擴大，連作重茬導(dǎo)致病原基數(shù)升高，更加重了西瓜枯萎病的發(fā)生。探究有效防治西瓜枯萎病的方法，已經(jīng)成為當今西瓜生產(chǎn)上亟須解決的問題[3]。

近年來，針對西瓜枯萎病的防治，國內(nèi)外學者已經(jīng)做了大量研究。目前，我國培育的抗病品種主要有西農(nóng)8號、京抗1號、秀麗等[4-6]，但由于西瓜遺傳多樣性極低，因此可被選育的抗病種質(zhì)資源非常有限[7]，而且常規(guī)育種周期長，進度慢，技術(shù)難度系數(shù)高，所育出的抗病品種只是相對抗病，生命力不強，易受周圍環(huán)境的影響[8]，無法從根本上解決問題;化學藥劑對西瓜枯萎病的治理能夠得到顯著效果[9-11]，但其所產(chǎn)生的藥物殘留會造成環(huán)境污染，傷害非靶標生物，甚至破壞生態(tài)平衡，嚴重制約西瓜產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展;利用葫蘆、冬瓜等植物的根類進行嫁接栽培對防治西瓜枯萎病的治理有很好的效果并得到廣泛應(yīng)用[12]，但工作量大，會影響西瓜正常的生長發(fā)育及果實的口感，西瓜品質(zhì)也會下降[2];物理手段防治西瓜枯萎病能夠起到一定的防治效果[13]，但工作量較大。基于以上防治措施存在的問題，生物防治利用有益微生物或拮抗微生物抑制西瓜尖孢鐮刀菌的生長，降低土壤中該病菌的數(shù)量，從而控制枯萎病病害的發(fā)生，是目前最有效且安全的防治手段[3]。因此，筆者所在實驗室從西瓜根際篩選出一株FON的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌LZN01，研究其發(fā)酵上清液的穩(wěn)定性和抑菌效應(yīng)，旨在為后續(xù)生防菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用和貯存提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥品 磷酸緩沖液（pH值為7.2）：配制磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉儲液，稱取磷酸氫二鈉138 g和磷酸二氫鈉142 g，分別溶于適量水中，待其溶解后定容至1 L;量取 72 mL 磷酸氫二鈉溶液和28 mL磷酸二氫鈉溶液，混合后即得到pH值為7.2的磷酸緩沖溶液，4 ℃冰箱保存;2.5%戊二醛緩沖溶液：0.2 mol/L磷酸緩沖液50 mL加25%戊二醛溶液10 mL，雙蒸水定容至100 mL。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡糖糖20 g、蒸餾水1 000 mL，固體加瓊脂，120 ℃滅菌20 min;溶菌肉湯（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 8 g、蒸餾水1 000 mL，120 ℃滅菌20 min。

1.1.3 菌株來源 解淀粉芽孢桿菌LZN01于2016年4月從黑龍江省齊齊哈爾市扎龍自然保護區(qū)采集的腐殖土和黑龍江省田雨綠色農(nóng)業(yè)工程有限公司的雞糞堆肥中取樣，并經(jīng)常溫（30 ℃）及高溫（50 ℃）多代馴化、篩選得到;尖孢鐮刀菌由東北農(nóng)業(yè)大學園藝實驗室提供。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 生理生化鑒定 生理生化試驗方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]，接觸酶試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、耐鹽性試驗（2、5、7、10、20 g）、檸檬酸銨利用試驗、酷素水解試驗方法均參照文獻[15]。

1.2.2 菌株16S rDNA測序 以LZN01菌株基因組DNA為模板，采用細菌通用引物sgF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進行PCR擴增。反應(yīng)體系為2.0 μL10×Ex Taq buffer，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.8 μL Primer 1，0.8 μL Primer 2，0.5 μLTemplate，0.2 μL 5 U Ex Taq，14.1 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，24個循環(huán);72 ℃延伸10 min。序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測定，菌株測序結(jié)果于NCBI進行Blast比對，鑒定菌株[16-17]。

1.3 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON菌絲生長的影響

解淀粉芽孢桿菌LZN01菌株對FON菌絲生長的影響：采用平板對峙培養(yǎng)法，在PDA平板中央接入已培養(yǎng)5 d的FON菌碟（直徑為5 mm），培養(yǎng)48 h后，在距致病菌2 cm處接入已培養(yǎng)24 h的解淀粉芽孢桿菌LZN01，置于30 ℃恒溫暗箱中5 d，以不接解淀粉芽孢桿菌LZN01的平板為對照，待對照組菌株長至滿盤時觀察[18]。

解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液對FON菌絲生長的影響[19]：將解淀粉芽孢桿菌LZN01菌體接入盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，制成種子液。再將1 mL種子液接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，再將上清液用0.02 μm過濾器過濾，即得發(fā)酵上清液，保存于4 ℃冰箱備用。

將解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液與未凝固的培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 1、1 ∶ 3混合，以培養(yǎng)基與無菌水按同樣比例混合作為空白對照，待培養(yǎng)基凝固后，在平板上接種FON菌碟（直徑為5 mm），30 ℃培養(yǎng)5 d（3組平行試驗），待對照菌落長滿平板2/3時，用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.4 解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液對FON形態(tài)的影響試驗

挑取PDA平板中培養(yǎng)5 d的FON菌絲懸浮于無菌水中，經(jīng)過6層紗布過濾后，室溫下10 000 r/min離心5 min收集孢子，用PDA培養(yǎng)基制備孢子懸浮液并調(diào)節(jié)濃度至 106 CFU/mL。將解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液與FON孢子懸液按體積比1 ∶ 1混合后，放入培養(yǎng)皿（鋪著已滅菌的濕潤濾紙）中，以無菌水與FON的孢子懸液按同樣比例混合作為空白對照，在30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12 h。分別吸取混合液滴在蓋玻片上風干，使用2.5%戊二醛緩沖液固定，置于4 ℃冰箱中過夜，再用pH值為7.2的磷酸緩沖液將其固定，沖洗2次，依次將樣品置于濃度為50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中脫水置換，每級脫水時間為10～15 min，最后置換100%乙醇加無水硫酸銅脫水10～15 min，置于冷凍室固化1夜，每組3個平行，掃描電鏡下觀察其形態(tài)[20]。

1.5 解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液對FON孢子萌發(fā)的影響

按“1.4”節(jié)中方法制備孢子懸浮液，向已滅菌的離心管中加入10 μL孢子懸液，按體積比1 ∶ 1加入解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液，以同樣比例的FON孢子懸液和無菌水為對照，混合均勻后，倒入無菌凹玻片中，放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每組3個平行試驗。分別在6、12、24 h時鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況。按下列公式計算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)總孢子數(shù)×100%;

孢子萌發(fā)抑制率=對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率對照孢子萌發(fā)率×100%。

1.6 解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液抑菌能力的穩(wěn)定性試驗

1.6.1 pH值對抑菌能力的影響 將發(fā)酵上清液分別用 1 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10，處理1 h，再將pH值調(diào)回到初始pH值（初始pH值為6.6），測定其抑菌活性，以無菌水作對照，比較處理前后菌絲變化情況，計算抑菌率。

1.6.2 溫度對抑菌能力的影響 將發(fā)酵上清液分別置于-20、0、4、20、60、80、100、120 ℃條件下保溫30 min，室溫平衡 3 min 后測定解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

菌株解淀粉芽孢桿菌LZN01生理生化指標鑒定見表1，接觸酶試驗陽性，淀粉水解試驗陽性，V-P試驗陽性，不能利用檸檬酸銨，酷素水解試驗陽性。菌株在NaCl含量>5%的固體培養(yǎng)基中不生長。

2.2 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON菌絲生長的影響

平板對峙試驗表明，當對照FON（圖2-A）長滿培養(yǎng)皿時，試驗組FON的生長呈現(xiàn)規(guī)避解淀粉芽孢桿菌LZN01的現(xiàn)象（圖2-B），說明解淀粉芽孢桿菌LZN01能夠抑制FON的菌絲生長;當解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液與培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 1和1 ∶ 3比例混合后，F(xiàn)ON菌落直徑分別為 2.77、1.79 cm（圖2-C、圖2-D），其抑菌率分別為34.82%、57.07%，說明解淀粉芽孢桿菌LZN01能夠顯著抑制FON的生長。

2.3 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON微觀形態(tài)的影響

本試驗用解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液處理FON后，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ON菌絲數(shù)量明顯減少，菌絲變細，表面變得粗糙、模糊，菌絲末端膨大變形（圖3-B），說明FON菌絲生長受到抑制且細胞表面受損（圖3）。此結(jié)果與菌落生長受抑制的試驗結(jié)果一致。

2.4 解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON孢子萌發(fā)的影響

由圖4可知，F(xiàn)ON孢子懸液與解淀粉芽孢桿菌LZN01上清液按體積比1 ∶ 1混合，培養(yǎng)6、12、24 h后的孢子萌發(fā)率分別為2.40%、18.20%、42.17%，孢子萌發(fā)抑制率分別為 86.21%、67.50%、56.05%，隨著時間的增加孢子萌發(fā)抑制率呈下降趨勢，可以看出解淀粉芽孢桿菌LZN01能顯著抑制FON的孢子萌發(fā)。

2.5 解淀粉芽孢桿菌LZN01抑菌能力的穩(wěn)定性試驗

由圖5可知，溫度在-20 ℃～60 ℃時，發(fā)酵上清液的抑菌活性較為穩(wěn)定，抑菌率基本保持在40%左右，當溫度高于 80 ℃ 時抑菌活性快速減弱，在100、121 ℃時抑菌率僅為 4.33%、2.20%。pH值在4～9范圍內(nèi)抑菌率穩(wěn)定且維持在60%左右，而在此范圍內(nèi)pH值為6時抑菌率為56.12%，低于其他pH值時的抑菌率。因此，解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液的抑菌功能物質(zhì)在pH值為4～9、-20 ℃～60 ℃溫度下生長能發(fā)揮更好的抑菌作用。

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON具有很好的抑菌效果，對FON孢子的萌發(fā)抑制作用顯著;FON在被解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液處理后，菌絲表面有嚴重受損現(xiàn)象;解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好，耐酸耐堿，具有良好的應(yīng)用前景。

芽孢桿菌的篩選及其抑菌功能的研究對農(nóng)業(yè)生物防治極其重要[19]。筆者所在實驗室從西瓜根際分離得到一株解淀粉芽孢桿菌LZN01，對FON具有很強的抑制作用。目前，國內(nèi)外的拮抗菌株對FON的抑制率較低，其中對香蕉枯萎病菌的抑制率為41%[21]，拮抗細菌對棉花枯萎病菌的抑制率為32%[22]，解淀粉芽孢桿菌HAB-7對芒果炭疽菌的抑制率為52.03%[23]，解淀粉芽孢桿菌對西瓜枯萎病的防治效果為 48.78%[24]。與前人研究結(jié)果相比，筆者所在實驗分離得到的解淀粉芽孢桿菌LZN01對FON的抑菌率達57.07%，抑菌效果顯著，具有很大的開發(fā)和應(yīng)用價值。

通過掃描電鏡觀察被解淀粉芽孢桿菌作用的病原真菌FON菌絲細胞發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ON菌絲數(shù)量明顯減少，菌絲邊緣變模糊，菌絲末端膨大變形，表明解淀粉芽孢桿菌抑制了病原真菌菌絲的正常生長，與前人研究結(jié)論[15，25-27]一致。解淀粉芽孢桿菌分泌的抗菌蛋白[15]或脂肽類物質(zhì)[27]在FON細胞膜上形成孔道，造成細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。導(dǎo)致電化學勢的喪失，細菌最終不能保持正常滲透壓[28-29]，從而導(dǎo)致細胞的死亡[26，30]。因此，可以推測解淀粉芽孢桿菌LZN01能夠分泌某些抗菌物質(zhì)，從而達到抑制病原真菌的目的[19]。水稻根系分泌物對FON孢子萌發(fā)的抑制率可達37.8%～41.0%[31]，青霉菌、放線菌株和石灰水對FON孢子萌發(fā)抑制率為21.49%～71.97%[32]，拮抗細菌對香蕉枯萎病菌孢子萌發(fā)抑菌率為 53.3%～80.2%%[22]。本研究的解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵上清液對FON孢子懸浮液6 h抑制率為86.21%，高于已報道的生防菌株，優(yōu)勢明顯。

解淀粉芽孢桿菌CMN1308隨溫度的升高抑菌效果增加[33]，而本研究溫度在-20 ℃～60 ℃時抑菌效果穩(wěn)定，80 ℃ 以上抑菌率急速下降;解淀粉芽孢桿菌CMN1308只耐堿[22]，而本研究中pH值為3～10范圍內(nèi)均有抑制效果，pH值在4～9范圍內(nèi)抑菌率在60%左右。解淀粉芽孢桿菌LZN01發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好，耐酸耐堿，為探索西瓜枯萎病生物防治技術(shù)和微生物制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供了理論與技術(shù)支持。

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