大熊貓雙胞胎生長(zhǎng)發(fā)育影響因素的研究

王樹群， 奉永友， 陳波， 吳孔菊， 方俊， 謝意， 黃祥明

(成都大熊貓繁育研究基地，瀕危動(dòng)物繁殖與保護(hù)遺傳省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610081)

大熊貓Ailuropodamelanoleuca是國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，有“活化石”和“中國(guó)國(guó)寶”之稱，屬于食肉目Carnivora大熊貓科Ailuropodinae，雖然大熊貓幼仔初生體質(zhì)量?jī)H約為母體體質(zhì)量的1/1 000，而體型相似的黑熊Ursusthibetanus幼仔的該比例為1/200～1/300(胡錦矗，2001)。經(jīng)多年探索，圈養(yǎng)大熊貓營(yíng)養(yǎng)和管理技術(shù)逐漸成熟，幼仔的存活率在2005年達(dá)79.8%(趙學(xué)敏，2006)，且2006年育活初生體質(zhì)量最輕的大熊貓幼仔(黃祥明等，2011)。2018年《大熊貓保護(hù)與繁殖國(guó)際大會(huì)暨大熊貓繁育技術(shù)委員會(huì)年會(huì)》發(fā)布數(shù)據(jù)，全球圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達(dá)到548只。大熊貓雙胞胎存活率也從45.5%(黃炎等，2001)提高到95%(王海瑞等，2015)。實(shí)踐證明，養(yǎng)育存活的大熊貓雙胞胎幼仔與單胎幼仔相比在生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖能力上并無顯著差異，所以雙胞胎存活率的提高直接促進(jìn)了整個(gè)圈養(yǎng)大熊貓種群繁殖效率的提高(王海瑞等，2015)。

雖然大熊貓雙胞胎存活率不斷提高，但是影響大熊貓雙胞胎生長(zhǎng)發(fā)育因素的報(bào)道極少，因此，通過大熊貓母獸孕期增重、雙胞胎個(gè)體性別、雙胞胎性別類型(雙雄性、雙雌性和異性)和大熊貓幼仔的初生體質(zhì)量等方面綜合分析研究大熊貓雙胞胎個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的影響因素，不僅可以有效指導(dǎo)不同性別和初生體質(zhì)量大熊貓幼仔與大熊貓母獸孕期的營(yíng)養(yǎng)供給，而且還可以為大熊貓雙胞胎幼仔生長(zhǎng)發(fā)育的理論研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

以成都大熊貓繁育研究基地的22只母獸及其在2013—2016年繁育的22對(duì)大熊貓雙胞胎(♂22，♀22)為研究對(duì)象，其中，2013年4對(duì)，2014年3對(duì)，2015年6對(duì)，2016年9對(duì)(表1)。

1.2 育幼管理

大熊貓雙胞胎幼仔采用人工輔助育幼：在產(chǎn)仔當(dāng)日取出其中一只人工喂奶、護(hù)理，每隔1～1.5 h與母獸哺育的另一只交換，保證每只幼仔及時(shí)吃到初乳，1～5 d內(nèi)遵循先在母獸處吃乳，若未吃到再進(jìn)行人工補(bǔ)喂母乳或者配奶(由美贊臣A+和美國(guó)PetAg 幼犬奶粉與水混合形成的濃度25%的配奶)的飼喂原則，若幼仔無法含住乳頭，則人工將幼仔移到母獸乳頭處；此外，根據(jù)每只幼仔體質(zhì)量增長(zhǎng)、食欲等每天隨時(shí)調(diào)整返回母獸處的次數(shù)和補(bǔ)喂的人工配奶和母乳的數(shù)量；2～3月齡時(shí)每天早上將雙胞胎中的一只補(bǔ)喂人工配奶而另一只回到母獸處吃母乳，待其吃好母乳后，將另一只也返回母獸處，5月齡后除了每天晚上喂1次人工配奶外，2只幼仔全天與母獸待在一起；具體人工輔助方法、環(huán)境控制等參考黃祥明等(2001，2005)的標(biāo)準(zhǔn)；此外，早期每天定時(shí)稱量每只幼仔的體質(zhì)量，3月齡后改為每晚稱量1次；母獸體質(zhì)量每月定時(shí)稱量1次，母獸孕前體質(zhì)量為母獸配種前的體質(zhì)量，母獸分娩時(shí)體質(zhì)量為母獸分娩前的體質(zhì)量，母獸孕期增重=母獸分娩時(shí)體質(zhì)量-母獸孕前體質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

母獸孕期增重、雙胞胎個(gè)體性別和雙胞胎性別類型與大熊貓雙胞胎幼仔初生體質(zhì)量之間的關(guān)系、不同雙胞胎個(gè)體性別和不同初生體質(zhì)量與不同月齡幼仔體質(zhì)量之間的關(guān)系采用一般線性模型中的多變量方差分析。目前大熊貓母獸孕期增重尚無明確劃分標(biāo)準(zhǔn)，但在人類孕婦的相關(guān)研究中以孕期增重低于10 kg視為增重不足(孫正芳等，2013)，因此，本研究以孕期增重10 kg為標(biāo)準(zhǔn)。

用雙胞胎初生體質(zhì)量差異程度(difference of birth mass，D)(張春麗，張寧，2012)表示1對(duì)雙胞胎2只個(gè)體的初生體質(zhì)量差異值，可直觀表示出這 2只個(gè)體在母體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育情況，D=(Wmax-Wmin)×100/Wmax，其中，Wmax表示較大個(gè)體的體質(zhì)量，Wmin表示較小個(gè)體的體質(zhì)量。目前動(dòng)物雙胞胎初生體質(zhì)量差異程度尚無明確的劃分標(biāo)準(zhǔn)，但是人類雙胞胎以初生體質(zhì)量差異≥20%作為診斷標(biāo)準(zhǔn)(楊孜，2009)，因此，本研究采用20%作為初生體質(zhì)量差異分界線，并對(duì)雙胞胎性別類型和初生體質(zhì)量差異程度進(jìn)行Cramer’s V相關(guān)分析，而雙胞胎初生體質(zhì)量差異程度則用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)以Post hoc testing檢驗(yàn)調(diào)整后的標(biāo)化殘差判斷各組的差異，當(dāng)調(diào)整后標(biāo)化殘差的絕對(duì)值大于1.96時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別類型雙胞胎的平均初生體質(zhì)量采用單因素方差分析。

表1 22對(duì)大熊貓雙胞胎幼仔基本信息Table 1 Basic information of 22 giant panda twin cubs

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 20.0中進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 大熊貓雙胞胎初生體質(zhì)量

大熊貓幼仔初生體質(zhì)量差異分析結(jié)果顯示，雙胞胎性別類型顯著影響大熊貓幼仔初生體質(zhì)量(P=0.015)，其中，雙雌性雙胞胎和異性雙胞胎中較大個(gè)體的初生體質(zhì)量顯著大于較小個(gè)體(P<0.05)，但是母獸孕期增重(P=0.257)和雙胞胎個(gè)體性別(P=0.170)卻對(duì)大熊貓幼仔初生體質(zhì)量無顯著影響(表2)。

不同雙胞胎性別類型的個(gè)體初生體質(zhì)量差異程度不同(χ2=9.043，P=0.041)，且雙胞胎性別類型與幼仔初生體質(zhì)量呈中等強(qiáng)度相關(guān)關(guān)系(Cramer’s V=0.492，P=0.030)：雙雌性雙胞胎個(gè)體的初生體質(zhì)量差異集中于20%～40%(調(diào)整后的標(biāo)化殘差：2.30)，極少低于20%(調(diào)整后的標(biāo)化殘差：-2.00)；雙雄性雙胞胎個(gè)體的初生體質(zhì)量差異小于20%(調(diào)整后的標(biāo)化殘差：2.60)；異性雙胞胎個(gè)體的初生體質(zhì)量差異雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(調(diào)整后的標(biāo)化殘差：1.8)，但差異程度大于40%。雙雌性雙胞胎個(gè)體的平均體質(zhì)量為0.13 kg±0.01 kg，雙雄性的為0.15 kg±0.01 kg，異性的為0.14 kg±0.01 kg，但三者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.2 大熊貓雙胞胎幼仔1～12月齡的體質(zhì)量

分析1～12月齡大熊貓雙胞胎幼仔的體質(zhì)量后發(fā)現(xiàn)，大熊貓幼仔個(gè)體性別、初生體質(zhì)量及其交互作用對(duì)各月齡的體質(zhì)量均無顯著作用(P>0.05)(表4)。

表2 不同雙胞胎性別類型、雙胞胎個(gè)體性別和母獸孕期增重對(duì)大熊貓雙胞胎幼仔體質(zhì)量的影響Table 2 The effect of sex type of twins， individual sex and increasing of maternal gestational masson the birth mass of giant panda twin cubs

注： B. 雙胞胎中較大個(gè)體， S. 雙胞胎中較小個(gè)體；*雙胞胎的初生體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

Notes： B. individual with greater birth mass in twins， S. individual with lesser birth mass in twins；*there is a significant difference between the twins’ birth mass (P<0.05)

表3 雙胞胎個(gè)體的初生體質(zhì)量差異Table 3 The difference of birth mass in twins

表4 不同雙胞胎個(gè)體性別和初生體質(zhì)量對(duì)大熊貓幼仔體質(zhì)量的影響Table 4 The effect of individual sex and birth mass on the body mass of giant panda twin cubs

3 分析與討論

3.1 雙胞胎性別類型對(duì)大熊貓幼仔初生體質(zhì)量的影響

目前，關(guān)于動(dòng)物的雙胞胎性別類型與初生體質(zhì)量之間關(guān)系的報(bào)道極少，但在人類雙胞胎中研究較多(Fieni & Gramellini，2004；楊孜，2009；張春麗，張寧，2012)。人類雙胞胎初生體質(zhì)量差異程度大于20%視為雙胞胎生長(zhǎng)不一致，因雙胞胎類型(雙卵雙胞胎和單卵雙胞胎)不同，雙胞胎生長(zhǎng)不一致的原因有所差異，其中雙卵雙胞胎生長(zhǎng)不一致不僅有遺傳學(xué)方面生長(zhǎng)潛能差異的原因，還有2個(gè)胎盤之一未能夠占據(jù)理想而有利的子宮內(nèi)膜位置而得不到良好的血供和胎盤、系帶及胎兒等先天畸形的原因，但最主要的原因則是胎盤灌注不足；單卵雙胞胎生長(zhǎng)不一致的原因則是由于胎盤間血管吻合所致的胎兒間血流不平衡和2個(gè)胎兒間胎盤分配不均或所屬胎盤種植部位不當(dāng)，導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不均，從而使胎盤出現(xiàn)不均衡生長(zhǎng)，而其中胎盤的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)損害是最重要的因素(Fieni & Gramellini，2004；楊孜，2009)；因此，引起胎兒的營(yíng)養(yǎng)供給差異是導(dǎo)致雙胞胎生長(zhǎng)不一致最直接的原因。

本研究中，雙胞胎性別類型顯著影響大熊貓雙胞胎個(gè)體的初生體質(zhì)量(P=0.015)。相較于人類雙胞胎嬰兒初生體質(zhì)量的差異程度(女性雙胞胎>異性雙胞胎>男性雙胞胎；張春麗，張寧，2012)，大熊貓雙胞胎初生體質(zhì)量差異程度表現(xiàn)為異性雙胞胎>雌性雙胞胎>雄性雙胞胎，因此，大熊貓雙胞胎中存在雌性個(gè)體時(shí)2只個(gè)體的初生體質(zhì)量差異程度較大的現(xiàn)象與人類一致；原因可能是大熊貓雙胞胎胎兒在母體內(nèi)發(fā)育期間，懷雙胞胎的母獸體內(nèi)雌激素約為懷單胞胎母獸體內(nèi)雌激素的1.5倍，處于極高水平(王海瑞等，2015)，而動(dòng)物妊娠早期雌激素可以干預(yù)延緩子宮內(nèi)膜螺旋動(dòng)脈重塑，抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲，使胎盤結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，并且高雌激素水平會(huì)增加低體質(zhì)量?jī)旱娘L(fēng)險(xiǎn)(王樹芳，2015)，所以在高水平雌激素的胚胎期，雌性個(gè)體可能與另一個(gè)體競(jìng)爭(zhēng)而影響其中一只個(gè)體胎盤的分配(布)、生長(zhǎng)或結(jié)構(gòu)，從而影響胎盤的營(yíng)養(yǎng)供給和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 雙胞胎個(gè)體性別與大熊貓雙胞胎幼仔初生體質(zhì)量的關(guān)系

胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育受先天遺傳因素和母體子宮內(nèi)環(huán)境共同影響，而雙胞胎共用1個(gè)子宮，這為研究胎兒發(fā)育提供了相對(duì)穩(wěn)定的母體環(huán)境。劉定震等(2001)認(rèn)為雄性大熊貓初生體質(zhì)量較雌性大，而李明喜(2004)卻認(rèn)為雌性大熊貓初生體質(zhì)量較雄性大；相較于大熊貓，眾多學(xué)者研究了人類性別對(duì)嬰兒初生體質(zhì)量的影響，認(rèn)為由于男性與女性遺傳組成的差異，特別是Y染色體在對(duì)胎兒的體質(zhì)量增長(zhǎng)、形體發(fā)育、骨骼成熟和牙齒發(fā)育等方面可能存在的特別作用，從而使擁有XY染色體的男嬰初生體質(zhì)量比具有XX染色體的女嬰更大(?arkoetal.，1985；Glinianaiaetal.，2000；饒騰子等，2012)。在本研究中，大熊貓雙胞胎個(gè)體性別對(duì)幼仔初生體質(zhì)量未產(chǎn)生影響(P=0.170)，其原因可能是不同雙胞胎性別類型2只個(gè)體間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，所以不同性別類型雙胞胎總體發(fā)育較為一致。此外，在人類雙胞胎中，當(dāng)異性雙胞胎孕齡與女性雙胞胎相近，但長(zhǎng)于男性雙胞胎時(shí)，異性雙胞胎的女性個(gè)體初生體質(zhì)量則同女性雙胞胎相近，而異性雙胞胎的男性個(gè)體初生體質(zhì)量卻比男性雙胞胎大(Loosetal.，2001)，由此可見，胎兒孕齡影響其生長(zhǎng)發(fā)育；而在妊娠期由于受光周期、哺乳刺激、營(yíng)養(yǎng)或者激素等因素的影響，大熊貓胚胎在發(fā)育到胚泡階段時(shí)暫時(shí)進(jìn)入休眠狀態(tài)并不立即著床，在這個(gè)時(shí)期，胚泡或者停止細(xì)胞分化與增長(zhǎng)，以使其大小及內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定，或者經(jīng)歷一個(gè)少量細(xì)胞發(fā)生分化的緩慢增長(zhǎng)階段，在子宮內(nèi)漂浮游離較長(zhǎng)一段時(shí)間，當(dāng)環(huán)境適宜后，游離胚胎才開始在子宮內(nèi)著床并分化形成胎兒(Hodgesetal.，1984；欒黎明等，2005；Zhangetal.，2009)，而大熊貓雙胞胎的這種延遲著床現(xiàn)象比單胎更為明顯，因此，雖然大熊貓胚胎表現(xiàn)出的妊娠期最短85 d，最長(zhǎng)201 d(王海瑞等，2015)，但是胎兒在母獸體內(nèi)檢出到產(chǎn)仔的時(shí)間卻只有20～25 d(Kerseyetal.，2016)。所以，在各種性別類型雙胞胎總體發(fā)育一致和極短的子宮內(nèi)發(fā)育時(shí)間的條件下，大熊貓幼仔可能還沒有機(jī)會(huì)表達(dá)出雌雄個(gè)體間初生體質(zhì)量的差異。

3.3 母獸孕期增重與大熊貓雙胞胎幼仔初生體質(zhì)量的關(guān)系

目前，關(guān)于孕期增重與嬰兒初生體質(zhì)量關(guān)系的報(bào)道常見于人類孕婦(李荔荔等，2014；陳亞紅，葛麗亞，2016；毛亞飛等，2017)。一般認(rèn)為孕婦自身的營(yíng)養(yǎng)狀況尤其是孕期的營(yíng)養(yǎng)與胎兒的生長(zhǎng)和嬰兒初生體質(zhì)量密切相關(guān)，而孕婦孕期增重則可以綜合反映孕婦健康和營(yíng)養(yǎng)狀況；據(jù)報(bào)道，孕婦孕期增重與嬰兒初生體質(zhì)量呈正相關(guān)(李荔荔等，2014；毛亞飛等，2017)，是影響嬰兒初生體質(zhì)量的重要因素(陳亞紅等，2016)，當(dāng)孕婦孕期增重不足時(shí)，胎兒不僅可能無法達(dá)到其應(yīng)有的生長(zhǎng)潛力而小于胎齡出現(xiàn)胎兒生長(zhǎng)受限的現(xiàn)象(施夢(mèng)瑤等，2017)，而且還可能誘使胎兒早產(chǎn)(李荔荔等，2014)。在本研究中，大熊貓母獸孕期增重對(duì)幼仔的初生體質(zhì)量無明顯影響(P=0.257)，其原因可能是由于孕前期胚胎在子宮內(nèi)主要完成細(xì)胞分化、器官發(fā)育和胎盤功能建立，孕中晚期胚胎完成器官發(fā)育和胎盤功能建立后，能量才主要用于骨骼、肌肉和脂肪的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)胎兒體質(zhì)量快速增加(陳亞紅，葛麗亞，2016)，但是大熊貓胚胎發(fā)育不僅有延遲著床現(xiàn)象，而且胎兒在子宮內(nèi)生長(zhǎng)期不足1個(gè)月，所以大熊貓幼仔胚胎期物質(zhì)快速積累的時(shí)間極短，母獸孕期增重對(duì)其物質(zhì)積累影響有限。

3.4 雙胞胎個(gè)體性別和幼仔初生體質(zhì)量對(duì)大熊貓幼仔1～12月齡體質(zhì)量的影響

大熊貓雙胞胎個(gè)體性別和幼仔初生體質(zhì)量與幼仔生長(zhǎng)發(fā)育之間關(guān)系的報(bào)道較多。劉定震等(2002)和褚青坡等(2019)報(bào)道認(rèn)為雄性大熊貓個(gè)體初生體質(zhì)量大于雌性，由于大熊貓屬于典型的晚成性哺乳動(dòng)物，初生幼仔裸露無毛，雙眼未睜，無聽覺能力，極為弱小，對(duì)母獸的依賴性強(qiáng)，除了由母獸負(fù)責(zé)安全、保暖和清潔衛(wèi)生，主要靠從母乳中獲取營(yíng)養(yǎng)，因而初生幼仔對(duì)母乳的獲取能力、母獸的營(yíng)養(yǎng)狀況和哺育能力成為決定幼仔生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，而雄性個(gè)體的初生體質(zhì)量較大，在成長(zhǎng)過程中競(jìng)爭(zhēng)力更強(qiáng)、生長(zhǎng)速率更快。通過對(duì)家畜初生體質(zhì)量和性別對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛12月齡體質(zhì)量、薩福克羊6月齡體質(zhì)量和仔豬20日齡及60日齡體質(zhì)量與其初生體質(zhì)量相關(guān)(曹進(jìn)夫，1999；鄧勇等，2000；顧亞玲等，2008)，并認(rèn)為雄性個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育快，異化作用強(qiáng)，在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下的體質(zhì)量比雌性大。在本研究中，大熊貓幼仔在1～12月齡期間，初生體質(zhì)量較大個(gè)體與較小個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育并未表現(xiàn)出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P>0.05)，并且不同性別大熊貓幼仔的體質(zhì)量增長(zhǎng)與張和民等(2003)和李明喜(2004)的報(bào)道一致，其原因可能是劉定震等(2002)和褚青坡等(2019)報(bào)道的大熊貓幼仔采用的是母獸直接哺育，因而在大熊貓雙胞胎幼仔生長(zhǎng)發(fā)育早期，初生體質(zhì)量較大個(gè)體的活動(dòng)能力較大，母乳獲取能力更強(qiáng)，生長(zhǎng)發(fā)育更快；而初生體質(zhì)量過小的幼仔往往無力尋找母獸的乳頭和吮吸乳汁而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受限。本研究中的大熊貓幼仔不僅初生體質(zhì)量在性別間無差異而且在生長(zhǎng)發(fā)育早期皆采用人工輔助育幼，從而避免了體弱個(gè)體難以與體強(qiáng)個(gè)體競(jìng)爭(zhēng)的問題，而且當(dāng)幼仔在母獸處吃母乳時(shí)，人工將幼仔移至母獸乳頭處，讓幼仔吸乳，并設(shè)法讓母獸不將幼仔移開(黃祥明等，2005)，也避免了體弱個(gè)體找不到乳頭的問題，確保了大熊貓雙胞胎幼仔都獲得充足的初乳和母乳，因此，大熊貓幼仔在1～12月齡期間，人工輔助育幼可能降低了不同初生體質(zhì)量對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響。雖然成年雄性大熊貓?bào)w質(zhì)量略大于成年雌性(馮文和，張安居，1988)，但在1～12月齡的生長(zhǎng)發(fā)育中未能表現(xiàn)出性別間的差異，可能是人工輔助育幼延遲了其性別效應(yīng)。