基于COⅠ基因探討北京及其周邊地區(qū)跳鉤蝦種群遺傳結(jié)構(gòu)

崔昕宇， 劉宏廣， 李樞強(qiáng)*

(1. 中國(guó)人民大學(xué)附屬中學(xué)，北京100080；2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101)

跳鉤蝦Platorchestiajaponica隸屬于甲殼動(dòng)物亞門(mén)Crustacea端足目Amphipoda跳鉤蝦科Talitridae，是唯一一種棲息在湖泊、河流沿岸的陸生鉤蝦，主要分布于我國(guó)北京、河北、山西、陜西、山東，以及日本和朝鮮等(Hou & Li，2003)。跳鉤蝦具有抱卵行為，沒(méi)有自由的幼體階段，遷移能力較弱，其遷移必須借助水系的連通或者水生植物的攜帶。研究表明，陸生跳鉤蝦起源于海洋類(lèi)群，是由于中新世東亞海入侵驅(qū)動(dòng)其占據(jù)陸生生境，并在陸生生境中快速分化(Yangetal.，2013；楊璐等，2013)。跳鉤蝦的種群遺傳學(xué)研究較少，Cheng等(2011)基于形態(tài)和線(xiàn)粒體COⅠ基因序列的研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)臺(tái)灣跳鉤蝦與日本和中國(guó)大陸的跳鉤蝦存在顯著分化，可能為一個(gè)新種Platorchestiapaludosus。中國(guó)內(nèi)陸跳鉤蝦的地理格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道。

線(xiàn)粒體COⅠ基因是一段蛋白質(zhì)編碼基因，易擴(kuò)增、好比對(duì)，進(jìn)化速率較快，已被廣泛用于種群水平的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究(董夢(mèng)書(shū)等，2017)。本研究通過(guò)采集北京及其周邊地區(qū)的跳鉤蝦樣品，進(jìn)行COⅠ基因的序列測(cè)定，分析其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，探討系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及分化過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、保存和鑒定

跳鉤蝦野外采集直接用紗網(wǎng)沿草叢根部掃網(wǎng)，將新鮮樣品浸泡于95%酒精中，當(dāng)天更換酒精1次，-20 ℃長(zhǎng)期保存。本研究共收集到北京、河北、山西、陜西、山東等地22個(gè)采集點(diǎn)128只跳鉤蝦(表1)。

表1 跳鉤蝦樣品采集信息Table 1 Sampling information of Platorchestia japonica

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取跳鉤蝦頭部，使用TIANamp Genomic DNA試劑盒提取總DNA，按照說(shuō)明書(shū)操作。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

線(xiàn)粒體COⅠ基因擴(kuò)增引物為CrustF2(5’-GGTTCTTCTCCACCAACCACAARGAYA-3’； Costaetal.，2007)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAA-AAAATCA-3’； Folmeretal.，1994)。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL 10×buffer PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTP混合液，1 μL 10 pmol正、反向引物，0.15 μL Taq酶(5 U·μL-1)，17.35 μL ddH2O，1 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，51 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司用ABI3730測(cè)序儀雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得的測(cè)序峰圖利用Sequencher 4.5進(jìn)行正反鏈校對(duì)和編輯，刪除序列兩端的引物區(qū)；運(yùn)用MacClade 4.0(Maddison & Maddison，2000)進(jìn)行序列比對(duì)，并翻譯成氨基酸檢查是否存在假基因，有效序列形成數(shù)據(jù)矩陣。使用MEGA 7.0.21(Kumaretal.，2016)分析堿基組成、變異位點(diǎn)，并計(jì)算遺傳距離(p-distance)。選取Platorchestiapacifica(COⅠ基因GenBank登錄號(hào)：KC578473)、Platorchestiajoi(COⅠ基因GenBank登錄號(hào)：KC578512)為外群，采用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。ML分析用raxmlGUI 1.5b2(Silvestro & Michalak，2012)，通過(guò)1 000次自展值檢驗(yàn)計(jì)算支持率。BI分析用MrBayes 3.2.2(Ronquistetal.，2012)，以jModeltest 2.1.7(Posada，2008)所得最適模型參數(shù)Nst=6，運(yùn)算400萬(wàn)代，每1 000代取樣1次，去掉25%burnin，最終用收斂后的3 000棵樹(shù)構(gòu)建一致樹(shù)。采用DnaSP 6.12統(tǒng)計(jì)種群遺傳多樣性參數(shù)(Rozasetal.，2017)，使用Arlequin 3.5進(jìn)行分子變異分析(Excoffier & Lischer，2010)。運(yùn)用PopART 1.7(Leigh & Bryant，2015)中最小生成網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，分析單倍型間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

共獲取了128個(gè)跳鉤蝦樣本COⅠ基因部分序列(GenBank登錄號(hào)：MK048335～MK048350、MK048352～MK048365、MK048368、MK048370～MK048371、MK048374～MK048386、MK286468～MK286549)，序列長(zhǎng)度為623 bp，其中，保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別為567個(gè)、56個(gè)和38個(gè)。序列中無(wú)插入和缺失，T、C、A、G平均含量分別為38.1%、18.5%、25.3%、18.1%，A+T含量較高(63.4%)；G+C在密碼子第三位點(diǎn)的平均含量為19.5%，明顯低于第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)(47.9%和42.3%)。全部序列檢測(cè)到43個(gè)單倍型。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)分析

采用ML和BI法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖1)。43個(gè)跳鉤蝦單倍型分化為2個(gè)進(jìn)化支，來(lái)自北京東部、山西、陜西、河北、山東和北京西部的1個(gè)單倍型形成一支，來(lái)自北京西部的另外6個(gè)單倍型形成一支。

單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示出與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)相同的結(jié)果，跳鉤蝦的43個(gè)單倍型分化為2個(gè)進(jìn)化支，支系間有明顯的遺傳變異。北京東部及山西等地的支系包括36個(gè)單倍型，其中Hap1為最大共享單倍型，其他單倍型由Hap1通過(guò)一步或多步突變演化而來(lái)。北京西部支系包括6個(gè)特有單倍型，Hap16位于網(wǎng)絡(luò)中心，其余5個(gè)單倍型與Hap16相差1個(gè)或2個(gè)突變距離。Hap4為北京東部等地支系與北京西部支系共享單倍型。

2.3 遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)

跳鉤蝦整體單倍型多樣性為0.938，核苷酸多樣性為0.011 72(表1)。Hap1出現(xiàn)頻次最高(23)，包括北京東部(包括圓明園、昌平區(qū)沙河水庫(kù)、海淀區(qū)玉泉山、奧林匹克公園)、河北省靈壽縣牛城鄉(xiāng)，以及陜西省涇陽(yáng)縣王橋鎮(zhèn)共享單倍型。Hap16為北京西部3個(gè)采樣點(diǎn)共享單倍型，出現(xiàn)頻次為14。

Hap4為北京市延慶區(qū)官?gòu)d水庫(kù)與河北省永年縣廣府鎮(zhèn)共享單倍型，除此之外，2個(gè)采樣點(diǎn)各自有特有單倍型，河北省永年縣廣府鎮(zhèn)的3個(gè)樣品中有2個(gè)樣品共享單倍型Hap3，北京市延慶區(qū)官?gòu)d水庫(kù)的4個(gè)樣品中有2個(gè)樣品共享單倍型Hap16和Hap17，2個(gè)種群間的Fst值為0.522 6。

圖1 跳鉤蝦采樣點(diǎn)和基于COⅠ基因單倍型構(gòu)建的最大似然樹(shù)/貝葉斯樹(shù)
Fig. 1 The sampling sites ofPlatorchestiajaponicaand the Maximum Likelihood tree/Bayesian tree based onCOⅠgene haplotypes

a. 跳鉤蝦采樣點(diǎn)， 樣點(diǎn)編號(hào)同表1； B. 跳鉤蝦生態(tài)照(劉宏廣 攝)； C. 跳鉤蝦最大似然樹(shù)和貝葉斯樹(shù)， 分支上的數(shù)字分別是最大似然和貝葉斯支持率

a. Sampling sites ofP.japonica， with numbers the same as those in table 1； B. Photo ofP.japonica(photo by Liu Hongguang)； C. Maximum Likelihood and Bayesian tree ofP.japonica， numbers above the branches represent support values in ML/BI analyses， respectively

2.4 遺傳距離和遺傳分化系數(shù)

跳鉤蝦2個(gè)遺傳支系間遺傳距離為0.029±0.006，支系內(nèi)遺傳距離均為0.004±0.001。

分子變異分析結(jié)果顯示，2個(gè)支系間的遺傳變異組分為7.758 43，種群內(nèi)變異組分為1.345 71，二者占總遺傳變異組分的比率分別為85.22%、14.78%，F(xiàn)st值達(dá)到0.852 19，二者差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖2 基于COI基因的跳鉤蝦單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 The haplotype network of Platorchestia japonicabased on COI sequences

圓圈代表單倍型， 大小與單倍型頻率呈正比， 顏色與圖1相同， 紅色代表北京東部支系， 藍(lán)色代表北京西部支系； 小豎線(xiàn)代表突變； Hap4是北京東部支系與北京西部支系的共享單倍型， 單倍型與地理分布之間沒(méi)有嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系

Each circle means a haplotype， and the size of circles is proportional to haplotype frequency， color annotation is the same as that in fig. 1； red. east part of Beijing， blue. west part of Beijing； each short line represents one mutation step； haplotypes from geographical populations showed no apparent distinct genetic clade

3 討論

線(xiàn)粒體COⅠ基因不受標(biāo)本性別、發(fā)育階段的限制，在種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析中得到廣泛應(yīng)用(董夢(mèng)書(shū)等，2017)。遺傳多樣性是物種多樣性的基礎(chǔ)，是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提(李大命等，2018)。跳鉤蝦22個(gè)采樣點(diǎn)128只個(gè)體中共檢測(cè)到43個(gè)單倍型，單倍型多樣性為0.938，核苷酸多樣性為0.011 72，顯示出較高的遺傳多樣性，遺傳資源豐富，可以篩選環(huán)境敏感型表型，用作環(huán)境毒物監(jiān)測(cè)(Duanetal.，2000)。

跳鉤蝦地理遺傳結(jié)構(gòu)報(bào)道很少，盡管Cheng等(2011)的研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的跳鉤蝦與日本和中國(guó)大陸跳鉤蝦在形態(tài)和遺傳上有顯著的分化，但隨后更廣泛的研究結(jié)果表明跳鉤蝦并沒(méi)有顯著的地理種群遺傳結(jié)構(gòu)(Yangetal.，2013)。北京西部地區(qū)大部分單倍型形成一個(gè)單系群，但北京東部和西部并沒(méi)有明顯的地理阻隔，綜合北京西部的聚類(lèi)以及北京東部和西部仍然存在共享單倍型，這種聚類(lèi)可能由非地理遺傳差異引起，如取樣的局限性等，北京地區(qū)跳鉤蝦存在東西遺傳阻隔的可能性小，北京周邊地區(qū)跳鉤蝦是否存在地理種群遺傳結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步研究。本研究中，系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析都支持跳鉤蝦分化為2個(gè)進(jìn)化支。一支主要包括北京東部、山西、陜西、河北和山東等地的單倍型，分支內(nèi)各單倍型間存在1個(gè)或多個(gè)堿基突變；另一支主要包括北京西部延慶、門(mén)頭溝等地的單倍型，分支內(nèi)各單倍型間存在1個(gè)或2個(gè)堿基替代；兩分支存在16個(gè)堿基變異。分子變異分析顯示跳鉤蝦兩支系間Fst值(0.852 19)較高，按照Wright(1965)認(rèn)為Fst值大于0.15為高度遺傳分化，意味著檢測(cè)區(qū)域的跳鉤蝦可能來(lái)源于2個(gè)遺傳不同的地理種群。Yang等(2013)在中國(guó)大陸及臺(tái)灣地區(qū)更廣泛的取樣基于COⅠ基因的研究結(jié)果表明，跳鉤蝦地理種群結(jié)構(gòu)不明顯，但明顯分成2個(gè)遺傳不同的進(jìn)化支，這表明目前的跳鉤蝦可能存在2個(gè)遺傳不同的種群來(lái)源。已有研究表明，更新世冰期事件成為影響該地域動(dòng)物種群遺傳分化和遺傳多樣性的主要原因(白茜茜等，2018)，跳鉤蝦在冰期是否存在2個(gè)不同的大避難所，以及避難所的位置及冰期后的遷移擴(kuò)散等還需要進(jìn)一步的研究。

本研究運(yùn)用線(xiàn)粒體COⅠ基因探討了北京及其周邊地區(qū)跳鉤蝦的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)跳鉤蝦遺傳多樣性高，遺傳資源豐富，跳鉤蝦群體存在2個(gè)遺傳不同的進(jìn)化支，表明目前的跳鉤蝦具有2個(gè)來(lái)源。本研究在北京及周邊地區(qū)采集了128個(gè)樣本，鑒定了43個(gè)COⅠ基因序列單倍型，為中國(guó)地區(qū)跳鉤蝦種群遺傳結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究提供了重要的基礎(chǔ)資料。