黃偉峰， 黃玉蘭， 劉麗， 張林， 呂虹， 雷高鵬， 李莉， 劉科亮， 楊小蓉

(四川省疾病預(yù)防控制中心，成都610041)

隨著生命科學的迅速發(fā)展，實驗動物作為生命醫(yī)學研究的重要支撐條件(張越華，鄭秀青，2017)，其安全性和有效性越來越受到高度關(guān)注。按微生物、寄生蟲控制程度，實驗動物可分為4個等級，即普通動物、清潔動物、無特定病原體(specific pathogen free，SPF)動物和無菌動物(魏杰等，2014)。SPF動物是指除清潔動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的病原的實驗動物(田攀，2016)。實驗動物感染病原體后在實驗過程中發(fā)病或死亡，影響生理指標，干擾實驗結(jié)果的可靠性和準確性，導(dǎo)致實驗失敗。由于對實驗動物質(zhì)量的要求越來越高，許多生命科學研究要求使用SPF級及以上等級。

但實驗動物飼養(yǎng)與實驗過程中外界環(huán)境的污染難以避免(姜光瑤等，2010)，實驗動物感染病原體的報道屢見不鮮。金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(SA)是一種廣泛分布于環(huán)境中的革蘭氏陽性球菌，存在于空氣、土壤、水及物品上，在人和家畜的體表尤其在和外界相通的腔道中檢出率相當高，也是實驗動物最常見的易感病原體(鄒自英等，2014)。為確保實驗動物質(zhì)量、避免污染，查找金黃色葡萄球菌的來源和分析污染鏈，本實驗室連續(xù)多年對某實驗動物飼養(yǎng)場進行了監(jiān)測和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與試劑7.5%氯化鈉肉湯、高鹽甘露醇瓊脂(SP)平板、血瓊脂平板、腦心浸出液肉湯、凍干兔血漿。

1.1.2 主要儀器全自動微生物生化鑒定儀VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)(法國Biomerieux公司)、Veriti梯度PCR儀(美國ABI公司)、QIAxcel毛細管電泳儀(德國Qiagen公司)、脈沖場電泳儀(美國伯樂公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)、水浴搖床(英國Grand公司)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集2011—2017年共采集該實驗動物飼養(yǎng)場的SPF大鼠回盲腸內(nèi)容物35份；2017年采集實驗動物養(yǎng)殖室空氣自然沉降樣本2份，飼養(yǎng)人員鼻腔拭子8份，飼養(yǎng)人員手部涂抹拭子8份。

1.2.2 分離純化根據(jù)《實驗動物 金黃色葡萄球菌檢測方法(GB/T 14926.14-2001)》，標本直接劃線接種到SP平板、血瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，金黃色葡萄球菌在SP培養(yǎng)基上形成黃色菌落，在血瓊脂平板形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落。挑出可疑菌落，進行全自動生化鑒定和血漿凝固酶實驗。鼻腔拭子、手部涂抹拭子根據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗(GB 4789.10-2016)》進行處理。

1.2.3 金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcusprotein A， SPA)基因分型挑取金黃色葡萄球菌菌苔，用煮沸法提取DNA，PCR檢測SPA基因300～400 bp序列片段(Monacoetal.，2010)，引物F：5’-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3’，R：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’。反應(yīng)體系為：上下游引物各1 μL、dNTP 4 μL、10×Buffer 5 μL、TaKaRa酶 0.3 μL、模板3 μL，無菌純水加至50 μL，混勻，離心。擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用毛細管電泳檢測PCR產(chǎn)物，并對陽性結(jié)果進行雙向測序。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳(PFGE)實驗金黃色葡萄球菌PFGE標準分型方法參考美國CDC網(wǎng)站的方法(Centers for Disease Control and Prevention，2011)。取新鮮瓊脂純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌懸濁于TE中，調(diào)節(jié)麥氏濃度至4.2～4.4。菌懸液加入溶葡萄球菌酶與等體積1% Seakem Gold瓊脂混合制作plug。然后置于含蛋白酶K的細胞裂解液中裂解2 h，再用TE清洗干凈。切2 mm寬膠塊用 Sma Ⅰ內(nèi)切酶酶切；標準菌株H9812用Xba Ⅰ內(nèi)切酶酶切。電泳條件為最小分子量40 kb、最大分子量400 kb，初始脈沖4.0 s、終末脈沖40.0 s，泵速設(shè)為70，電泳溫度14 ℃，電壓梯度6 V·cm-1，電場夾角120°，電泳時間19 h 30 min。結(jié)束后用0.1 μg·mL-1Gelred染色30 min，純水中脫色30 min，凝膠成像儀上讀取圖像并保存。

1.2.5 聚類分析方法使用BioNumerics 6.6進行數(shù)據(jù)分析。用不加權(quán)算術(shù)平均組對法(UPGMA)對PFGE指紋圖譜進行聚類分析(楊小蓉等，2014)；用最大似然法對SPA測序結(jié)果進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 SPF大鼠中金黃色葡萄球菌檢出率

2011—2017年(2014、2016年未采集)采集的35份樣本檢出16株SA，檢出率45.71%。除2015年外，每年均從SPF大鼠中檢出SA，檢出率為2012年最低(20.00%)，2017年最高(100.00%)，2011、2013年均為60.00%(表1)。

表1 2011—2017年SPF大鼠中金黃色葡萄球菌檢出情況Table 1 Detection of Staphylococcus aureus in SPF rats during 2011-2017

2.2 飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)人員檢測結(jié)果

從采集的18份飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)人員樣本中檢出2株SA。其中，1份飼養(yǎng)環(huán)境空氣中檢出1株，1份飼養(yǎng)人員鼻腔拭子中檢出1株，飼養(yǎng)人員手部涂抹拭子中未檢出。

表2 飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)人員金黃色葡萄球菌檢出情況Table 2 Detection of Staphylococcus aureus inbreeding environment and rearing staff

2.3 SPA分型結(jié)果

該飼養(yǎng)場檢出的18株SA可分成5個SPA基因型別，T2360為主要型別(11株)，各菌株SPA型別見表3。對SPA測序結(jié)果用最大似然法進行聚類分析，5個SPA型別可以聚為4簇，聚類關(guān)系與分離年份有很強的相關(guān)性：2011年SPF大鼠的3株SA為T3022，與其他SPA型別的親緣關(guān)系較遠；2012年SPF大鼠的2株SA為T237；2013年和2017年SPF大鼠的11株SA都為T2360。雖然飼養(yǎng)場環(huán)境空氣中檢出菌株的SPA型別為T9001，但與來源于SPF大鼠的T2360聚為同一簇。飼養(yǎng)人員鼻腔檢出菌株的SPA型別為T127(圖1)。

圖1 18株金黃色葡萄球菌的SPA分型聚類分析Fig. 1 SPA typing of 18 Staphylococcus aureus strains

表3 18株金黃色葡萄球菌SPA分型結(jié)果Table 3 The result of SPA typing of 18 Staphylococcus aureus strains

圖2 18株金黃色葡萄球菌的PFGE分型聚類分析
Fig. 2 PFGE typing of 18Staphylococcusaureusstrains

2.4 PFGE分型結(jié)果

18株SA的PFGE有5個帶型，命名為SA1～SA5，可聚為2大類，一類由SA1和SA2組成，另一類由SA3～SA5組成；SA4為主要帶型，有11株SA。不同年份SPF大鼠中分離SA的PFGE帶型有明顯的差異：2011年、2012年的PFGE帶型與2013年、2017年差異較大；且2011年只有SA1一個帶型，2012年只有SA2一個帶型；2013年為SA3和SA4，2017年為SA4。飼養(yǎng)環(huán)境空氣、飼養(yǎng)人員中分離SA的PFGE帶型與SPF大鼠中SA的相似度分別為100.00%、86.90%。

3 討論

近年來，實驗動物中攜帶病原微生物多有報道，葛文平等(2012)檢測了5個單位不同品系SPF小鼠，發(fā)現(xiàn)其SA、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa的攜帶率分別為1.875%、1.875%和1.250%；馮潔等(2015)在422只SPF小鼠中，SA、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌的分離率分別為2.37%、0.47%和5.21%；Nobuhito等(2013)發(fā)現(xiàn)上千只動物和樣本中SA感染率比其他病原體更高，小鼠為18.8%，大鼠為58.6%。本研究對某實驗動物飼養(yǎng)場SPF大鼠進行SA連續(xù)多年監(jiān)測，檢出率達45.71%，與Nobuhito等(2013)的報道較為一致。

SPA分型方法主要是基于對SPA基因X區(qū)域可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)的多態(tài)性序列分析，由于編碼SPA的基因包含一定數(shù)目的24 bp重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)序列的數(shù)目、特征及排列順序不同而具有高度的多態(tài)性，且具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，適合分型(譚磊等，2008)。PFGE被認為是細菌分子分型的“金標準”，目前已被廣泛應(yīng)用于檢測不同來源菌株之間的關(guān)聯(lián)性(閆笑梅等，2009)。本研究運用這2種方法對分離株進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)同一年份分離株的PFGE和SPA型別均一致，說明同一年份分離株來自同一克隆系，不同年份的分離株之間親緣關(guān)系與分離年份相關(guān)性很強，且各年份分離SA的PFGE和SPA型別基本一一對應(yīng)。T2360和T9001的SPA基因前面5個重復(fù)序列一致，且其SPA序列能夠聚為同一簇，說明有這2個型別的菌株親緣關(guān)系非常近，可能是SPA基因X區(qū)域的堿基突變導(dǎo)致從第6個重復(fù)序列發(fā)生改變而型別不一致。這也解釋了飼養(yǎng)環(huán)境空氣中分離的SA菌株2017043，雖然其SPA型(T9001)與SPF大鼠中的T2360不一致，但其PFGE帶型與2013年和2017年SPF大鼠中的均為同一帶型(SA4)，這與SPA聚類分析結(jié)果一致，說明2017年飼養(yǎng)環(huán)境空氣中分離的SA菌株與2013、2017年分離的SA菌株親緣關(guān)系很近，有可能來自同一克隆株。同樣，2013年SPF大鼠中的SA有2個PFGE帶型(SA3和SA4)對應(yīng)了同一個SPA型別(T2360)，但SA3與SA4的相似度為90.90%，親緣關(guān)系較遠，說明這一批SPF大鼠可能感染了不同來源的SA。

本研究結(jié)果推斷，飼養(yǎng)環(huán)境空氣中分離的SA與引起SPF大鼠感染的SA具有緊密聯(lián)系，很可能是引起SPF大鼠感染的污染源。當然并不能忽視其他因素也有可能引起的實驗動物感染，比如引進受感染的種鼠或幼鼠未被檢出、飼養(yǎng)人員攜帶的病原微生物等。在飼養(yǎng)人員鼻腔拭子也分離到了SA菌株2017044，雖然其SPA型別與SPF大鼠中的不一致，PFGE帶型的相似度也僅為86.90%，不是引起本次實驗動物感染的菌株，卻是重要的潛在污染源。因此應(yīng)保持實驗動物飼養(yǎng)的無菌環(huán)境和工具清潔，加強動物密切接觸者的無菌操作規(guī)范，對每批引進種鼠或幼鼠進行檢測，并定期對飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)工具設(shè)備、飼養(yǎng)人員以及飼養(yǎng)動物進行病原微生物監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)隱患，找到污染源，切斷傳播途徑，避免感染的發(fā)生，為實驗動物的質(zhì)量和飼養(yǎng)人員的健康提供保證。