QuEChERS/氣相色譜三重四級桿質譜法測定枸杞籽油中多環(huán)芳烴類物質

朱 捷，馬桂娟，張 瑤，湯麗華

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院，銀川 750004)

枸杞籽為枸杞深加工的副產(chǎn)品，含有豐富的生物活性物質，其含油量為18%～22%，利用現(xiàn)代化萃取技術得到的枸杞籽油有效地保留了枸杞的多種功能成分，深受廣大消費者的喜愛。但目前關于枸杞籽油中多環(huán)芳烴檢測的研究較少，多集中于大豆油、菜籽油、花生油、橄欖油、玉米油等食用油脂[1-6]。

多環(huán)芳烴(PAHs)是由兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的一類中性或非極性有機化合物，其中的某些物質具有致突變性和致癌性[4]。國家食品安全標準GB 2762—2017中僅對苯并[a]芘作出了規(guī)定，其限量為10 μg/kg，歐盟對食用油脂中苯并[a]芘的限量為 2 μg/kg，還對4種PAHs(苯并[a]蒽、、苯并[a]熒蒽和苯并[a]芘)的總量作出了規(guī)定，不得超過10 μg/kg[5]。由于植物油中基質復雜，多環(huán)芳烴的檢測相對比較困難，目前的研究多數(shù)采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)和氣相色譜單四級桿質譜聯(lián)用儀檢測植物油中的多環(huán)芳烴[3,6-9]。但HPLC-FLD線性范圍較窄，且不能在同一波長下同時檢測多種多環(huán)芳烴。氣相色譜單四級桿質譜聯(lián)用儀雖然可以實現(xiàn)同時快速檢測多種多環(huán)芳烴，由于單四級桿只能實現(xiàn)選擇離子監(jiān)測方式(SIM)，而這種方式會造成基質影響較大以及目標物分離不完全的情況。如何高效準確地對植物油中多環(huán)芳烴進行檢測成為了目前研究的方向。

在檢測食品中多環(huán)芳烴的殘留時往往需要較為煩瑣的前處理[10-15]。QuEChERS是快速(Quick)、簡便(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的樣品處理技術的縮寫，現(xiàn)已被廣泛使用[14]。本文參考QuEChERS技術進行樣品前處理并結合氣相色譜三重四級桿質譜聯(lián)用(GC-MS/MS)分析法測定保健食品枸杞籽油中16種多環(huán)芳烴，探討其可行性，為枸杞籽油產(chǎn)品相關標準的起草提供一定的技術支撐，對食品安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

枸杞籽油膠丸，市售；16種多環(huán)芳烴標準品(200 μg/mL，1.0 mL)，北京曼哈格生物技術公司；乙腈(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，美國安捷倫科技公司；C18固相萃取填料，美國安捷倫科技公司；硅膠填料，迪馬科技有限公司；食用油中苯并[a]芘質控樣(QC-CO-702)，中國檢驗檢疫科學研究院分析測試中心。吸附填料使用前均需用乙腈浸泡處理，烘干備用。

1.1.2 儀器與設備

GCMS-TQ8040氣相色譜三重四級桿質譜聯(lián)用儀，日本島津公司；高速低溫離心機，德國Sigma公司；全自動樣品濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；渦旋混勻器，德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的提取與凈化

稱取枸杞籽油0.5 g于用乙腈浸泡過的10 mL玻璃管中，加入3.0 mL乙腈，渦旋1 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，重復該步驟再次提取，合并2次上清液，35℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL。加入200 mg PSA及100 mg C18凈化，渦旋1 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液供氣質聯(lián)用儀測定。

1.2.2 GC-MS/MS分析

色譜條件：HP-5MS UI毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度300℃；不分流進樣；載氣為氦氣(純度99.999%)，流速1.0 mL/min；程序升溫為初始溫度90℃，以20℃/min升至220℃，再以5℃/min升至320℃，保持2 min；自動進樣，進樣量1 μL。

建設單位向生產(chǎn)廠家派駐監(jiān)造工程師，對原材料、生產(chǎn)過程、成品檢驗進行全過程監(jiān)造。未經(jīng)監(jiān)造工程師簽字，原材料不得使用，產(chǎn)品不得交付。監(jiān)造工程師與建設、質量監(jiān)督、檢驗等單位密切配合，從源頭上嚴格控制生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)質量。

質譜條件：接口溫度280 ℃；電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度250℃；溶劑延遲時間2.7 min；四級桿溫度150℃；掃描方式為多反應檢測掃描(MRM)方式。16種多環(huán)芳烴保留時間及特征離子對如表1 所示。

表1 16種多環(huán)芳烴保留時間和特征離子對

1.2.3 溶液配制

16種多環(huán)芳烴標準品先用乙腈稀釋至2 μg/mL，再分別用基質提取液配制成1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合標準工作液。

2 結果與討論

2.1 16種多環(huán)芳烴的分離情況

以枸杞籽油為基質，加標40 μg/kg，當采用選擇離子監(jiān)測方式(SIM)時干擾較大，本文采用多反應檢測掃描(MRM)方式，檢測結果如圖1所示。

注：1.萘； 2.苊烯； 3.苊； 4.芴； 5.菲； 6.蒽； 7.熒蒽； 8.芘； 9.苯并[a]蒽； 10.； 11.苯并[b]熒蒽； 12.苯并[k]熒蒽； 13.苯并[a]芘； 14.茚并[1，2，3-c，d]芘； 15.二苯并[a，h]蒽； 16.苯并[g，h，i]芘。

圖1 樣品中添加16種多環(huán)芳烴的MRM圖

由圖1可以看出，采用MRM方式分析時基線穩(wěn)定，16種多環(huán)芳烴可基本分離，基質干擾非常小，能夠滿足檢測要求。

2.2 不同種類的吸附劑對回收率的影響

枸杞籽油中含有微量的水，大量的脂肪、有機酸、芳香烴類物質，目前較多研究中采用弗羅里硅土固相萃取柱、硅膠固相萃取柱以及C18固相萃取柱進行凈化[16-18]，此步驟較為耗時。PSA可與金屬離子產(chǎn)生螯合作用，可以有效去除脂肪酸、有機酸和一些極性色素及糖。C18的官能團含碳量10%，具有疏水作用，對中性、非極性的組分有吸附作用，如芳香油、脂溶性維生素。硅膠填料具有很強的吸附力，可以去除水、色素等物質。本文參考GB 5009.265—2016《食品安全國家標準 食品中多環(huán)芳烴的測定》以及市售QuEChERS試劑盒中凈化材料的種類及用量(100 mg PSA、100 mg C18及100 mg硅膠)，通過對枸杞籽油樣品進行加標回收實驗(n=3)，研究了3種常用吸附劑組合對多環(huán)芳烴回收率的影響，結果見表2。

表2 不同吸附劑組合對多環(huán)芳烴回收率的影響 %

由表2可以看出，采用PSA及C18凈化后16種多環(huán)芳烴的回收率在63.2%～109.3%之間，而用PSA及硅膠凈化后蒽、熒蒽、芘、、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽回收率在60%～110%之間，但萘、苊烯、苊、芴、菲等的回收率僅為30%左右，這可能是由于硅膠會吸附萘、苊烯、苊、芴、菲等相對分子質量較小的物質。用C18及硅膠凈化后多環(huán)芳烴的回收率明顯降低，大部分在60%以下，這可能是由于凈化不完全導致其他雜質對目標物造成影響。所以本實驗在樣品前處理中使用PSA與C18的組合方式進行凈化。另外，對PSA及C18的用量進行了優(yōu)化，將PSA的用量由100 mg增加到200 mg后，凈化后的樣品顏色較優(yōu)化前澄清，16種多環(huán)芳烴的回收率較優(yōu)化前明顯提高，這可能是由于PSA的增加吸附了更多的色素及脂肪類物質，使得多環(huán)芳烴的回收率提高，所以本文采用200 mg PSA與100 mg C18的組合方式進行實驗。

2.3 提取次數(shù)及乙腈體積對回收率的影響

在對樣品前處理過程進行優(yōu)化時，分別研究了3、5 mL以及10 mL乙腈進行提取，結果表明采用大體積乙腈進行提取時，僅有萘、苊烯、苊等少部分多環(huán)芳烴的回收率較高，其余物質的回收率變化不顯著，同時采用大量的乙腈也增加了吸附材料的使用量以及氮吹的時間，造成資源的浪費，所以采用3 mL乙腈為宜。對乙腈提取1次、2次以及3次時多環(huán)芳烴回收率進行比較，結果如表3所示。

表3 不同提取次數(shù)對多環(huán)芳烴回收率的影響 %

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍及回收率

本研究采用外標法定量，以各標準品的質量濃度為橫坐標(X)，各化合物響應值的峰面積為縱坐標(Y)建立標準曲線。加標回收實驗中采用直接向陰性枸杞籽油樣品中加入混合標準溶液的方式進行檢測，且添加不同質量濃度的標準品，其中添加的低質量濃度水平為40 μg/kg，高質量濃度水平為200 μg/kg。標準曲線回歸方程、相關系數(shù)(R2)及加標回收率見表4。由表4可以看出，16種多環(huán)芳烴在1～200 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(R2)均大于0.998，添加低、高質量濃度的標準品后16種多環(huán)芳烴的回收率在60.04%～119.00%之間，回收率的RSD為2.92%～13.03%。各目標化合物峰面積的RSD為0.6%～5.5%(n=6)，說明該方法重現(xiàn)性好。滿足GB/T 27404—2008的要求。

表4 16 種多環(huán)芳烴標準曲線回歸方程、相關系數(shù)及加標回收率(n=6)

2.4.2 檢出限、定量限及基質效應

孟繁磊等[19]采用標準曲線斜率比值的方法評價基質效應情況，若比值在0.85～1.15之間認為基質效應不明顯，本文參考其方法進行比較。用空白樣品為基質，添加不同量的混合標準品后測定，以信噪比(S/N)≥3 確定方法的檢出限(LOD) ，以信噪比(S/N)≥10確定方法的定量限(LOQ)，16種多環(huán)芳烴的檢出限、定量限及基質效應見表5。

表5 16種多環(huán)芳烴的檢出限、定量限及基質效應

由表5可知，16種多環(huán)芳烴的基質效應在85.1%～114.2%之間，可以認為基質效應不明顯。用外標法定量測定，16種多環(huán)芳烴的檢出限在0.2～3.5 μg/kg之間，定量限在0.7～11.5 μg/kg之間。

2.5 質量控制措施

本研究使用的玻璃器皿在使用之前均使用乙腈浸泡24 h后烘干，以消除玻璃器皿中多環(huán)芳烴類物質的污染。PSA及C18使用之前分別稱取10 g，加入30 mL乙腈超聲30 min，棄去上清液，重復該步驟3次，吸附填料經(jīng)烘干后備用。這樣可以有效減少外源多環(huán)芳烴的污染。

本研究還發(fā)現(xiàn)，樣品提取后于35℃氮吹近干的過程中氮氣流量過大會導致4種多環(huán)芳烴(萘、苊烯、苊、芴)的回收率偏低，而對其余的12種多環(huán)芳烴影響較小，其中萘、苊烯、苊、芴的回收率僅為正常值的50%左右。這可能是由于萘、苊烯、苊、芴的熔點較低，且易揮發(fā)，如果氮氣流量過大，粘在管壁上的物質會被氣流吹出，導致回收率下降。所以在氮吹時應注意控制氣流。同時在氮吹時也應注意氮吹溫度，當?shù)禍囟仍?0～55℃時管中殘渣會緊緊吸附在管壁上不易復溶，造成萘、苊烯、二苯并[a,h]蒽等物質回收率偏低，這可能是由于油性物質包裹多環(huán)芳烴吸附在管壁上引起的。

2.6 質控樣品的檢測

本研究中除了進行加標回收實驗外還將購買的苯并[a]芘質控樣以及歷年檢測中發(fā)現(xiàn)的苯并[a]芘超標的枸杞籽油作為普通樣品進行檢測，測得該質控樣中苯并[a]芘的含量為10.7 μg/kg，在質控樣的參考范圍值(11.3±1.3)μg/kg之內。苯并[a]芘超標的枸杞籽油復測結果的平均偏差在1.9%～3.2%之間。說明該法可靠有效。

2.7 QuEChERS前處理的優(yōu)勢

GB 5009.265—2016《食品安全國家標準 食品中多環(huán)芳烴的測定》中關于油脂含量較高的樣品的前處理采用乙腈提取，正己烷復溶，弗羅里硅土固相萃取柱凈化，正己烷-二氯甲烷洗脫，乙腈定容等過程，平均處理一個樣品需用1.5～2 h，且成本較高、毒害較大，同時萘、苊烯、苊、芴、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]芘的回收率僅為30%～40%，其余多環(huán)芳烴類物質的回收率在92%～107%之間。采用本文中QuEChERS前處理，平均處理一個樣品用時0.5 h左右，省時省力，16種多環(huán)芳烴的回收率在60.04%～119.00%之間，回收率較高。

3 結 論

建立了同時檢測保健食品枸杞籽油中16 種多環(huán)芳烴的QuEChERS/GC-MS/MS方法。采用含200 mg PSA和100 mg C18吸附填料粉進行凈化，凈化后采用GC-MS/MS進行分析測定。在優(yōu)化條件下，16種多環(huán)芳烴分離度良好，在1.0～200 ng/mL范圍內線性關系良好。通過QuEChERS的樣品前處理方法能獲得較高的回收率，其回收率在60.04%～119.00%之間，回收率的RSD為2.92%～13.03%;方法的檢出限在0.2～3.5 μg/kg之間，定量限在0.7～11.5 μg/kg之間。該法可顯著降低實驗成本，且降低了對實驗者及環(huán)境的污染風險；采用MRM方式顯著提高了檢測的準確性和選擇性，有效地排除了干擾；該方法經(jīng)濟、可靠，并且簡單、快速，能夠滿足保健食品枸杞籽油中多環(huán)芳烴在日常檢測中的要求。