張斌斌 王湘琦 趙超然 熊愛兵

[摘要]目的：本實驗探討抑制PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導(dǎo)人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞凋亡作用及其機制。方法：用順鉑處理人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞后Western blot檢測細胞凋亡、PI3K/AKT/mTOR通路的活化情況以及細胞增殖-毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）。用PI3K的抑制劑LY294002（LY）和mTOR的抑制劑雷帕霉素（Rapamycin，Rap）分別預(yù)處理以研究其對順鉑處理后人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞凋亡的協(xié)同作用。為進一步探索阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑處理后人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞凋亡的協(xié)同作用機制，采用Western blot檢測阻斷PI3K/AKT/mTOR后聯(lián)用順鉑處理人皮膚黑素瘤細胞株A375細胞中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達。結(jié)果：順鉑處理后的A375黑素瘤細胞中PARP的活化剪切體表達量水平呈濃度和時間依賴性增加，細胞活力呈濃度和時間依賴性降低（P<0.05）。順鉑處理A375黑素瘤細胞后PI3K/AKT/mTOR通路的活化。阻斷PI3K/AKT/mTOR通路再用順鉑聯(lián)合處理A375黑素瘤細胞后PARP的活化剪切體表達量明顯上調(diào)以及細胞活力明顯降低（P<0.05）。阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后再用順鉑聯(lián)合處理A375黑素瘤細胞發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白和Bcl-xl表達水平下調(diào)。結(jié)論：阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡具有協(xié)同作用，該協(xié)同作用可能與Bcl-2和Bcl-xl蛋白下調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]PI3K/AKT/mTOR;Bcl-2;黑素瘤細胞;A375;順鉑;凋亡

[中圖分類號]R732.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）08-0072-05

黑素瘤（melanoma）是起源于黑素細胞的惡性腫瘤，常發(fā)生在皮膚、黏膜等。近年來，黑素瘤的發(fā)病率和死亡率正在逐步增加[1-4]。它的發(fā)生、發(fā)展與紫外線照射時間延長、女性激素、砷化物、酒精、輻射和飽和脂肪等有關(guān)[5-6]。目前對于黑素瘤的治療方案有手術(shù)治療、藥物治療和分子靶向治療。盡管手術(shù)切除治療黑素瘤是一種有效的手段，但是術(shù)后往往容易導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)、患者生存率不盡人意[7-8]。此外，近年來對于黑素瘤的藥物化療研究逐漸增多，但是由于其腫瘤產(chǎn)生的耐藥性、藥物化療效果并不理想，所以有必要探討新的治療策略。有研究報道顯示，藥物化療與分子靶向治療在抗腫瘤中具有很好的抑制作用[9-10]。因此，本文探討藥物與分子靶向在黑素瘤中的作用及機制。

順鉑（cisplatin）是中心以二價鉑同兩個氯原子和兩個氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物，類似于雙功能烷化劑，可抑制DNA的復(fù)制過程，也是腫瘤治療中的常用化療藥物，其誘導(dǎo)肝癌、肺癌和卵巢癌等各種腫瘤細胞凋亡[11-12]。但是，順鉑誘導(dǎo)人皮膚黑素瘤細胞凋亡及凋亡耐受的具體機制卻少有人報道。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）是近年來研究較為廣泛的信號通路之一，該通路可抑制多種毒性刺激誘導(dǎo)的細胞死亡，其作用在各類腫瘤細胞都有所體現(xiàn)[13-17]。因此，探討黑素瘤細胞耐受順鉑的機制是否與PI3K/AKT/mTOR通路有關(guān)具有重要意義。

本實驗通過Western blotting、CCK-8等方法分析順鉑對A375黑素瘤細胞的影響，阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后再用順鉑對A375黑素瘤細胞的凋亡和細胞活力影響及阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑對A375黑素瘤細胞凋亡的機制進行研究。

1? 材料和方法

1.1 藥品與抗體：PI3K抑制劑（LY294002，LY）、mTOR抑制劑Rapamycin（Rap）購自美國Santa Cruz公司，順鉑（Cisplatin）購自美國Selleck Chemicals公司?？筆ARP（PARP，poly ADP-ribose polymerase）、p-AKT（Ser473） 、AKT、p-P70S6K、P70S6K、Bcl-2、Bcl-xl一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。人皮膚黑素瘤細胞株A375購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 細胞培養(yǎng)：人皮膚黑素瘤細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2，37℃孵箱。視細胞生長情況換液，待細胞生長達到對數(shù)生長期時進行實驗研究。

1.3 Western blot分析：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠（ SDS-PAGE）電泳分離蛋白質(zhì)，采用hoefer半干電轉(zhuǎn)移將蛋白分子轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜加入5%牛血清白蛋白進行封閉，室溫輕搖封閉1h。待封閉結(jié)束后，1×TBST洗滌3次（5min/次）后，PVDF膜與一抗稀釋液室溫下輕搖動孵育30min，4℃冰箱過夜，回收一抗，1×TBST洗滌3次（5min/次）。PVDF膜與熒光二抗稀釋液于室溫下輕搖動孵育1h，回收二抗，1×TBST洗滌3次（5min/次） 。Odyssey-CLX掃描顯影。

1.4 蛋白提取：采用不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激A375黑素瘤細胞24h后提取蛋白;采用順鉑（10mg/ml）處理A375黑素瘤細胞12h、24h、36h，分別提取每個時間點的蛋白;LY294002（PI3K通路抑制劑）預(yù)處理黑素瘤細胞A375中1h后聯(lián)用順鉑（10mg/ml）處理12h，24h，提取蛋白;Rap（mTOR通路抑制劑）預(yù)處理黑素瘤細胞A375中1h后聯(lián)用順鉑（10mg/ml）處理12h，24h，提取蛋白;依據(jù)以上實驗分組情況，待藥物處理達到預(yù)定時間后，棄掉六孔板中培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，隨即向各孔中加入適量含蛋白酶抑制劑的IP裂解液（約100μl），輕微晃動，使IP裂解液覆蓋所有細胞，將六孔板置于冰上約15min。用細胞刮將細胞刮下并用1.5ml EP管收集，用超聲波細胞粉碎冰上超聲破碎細胞，超聲3次（5s/次）。用4℃低溫離心機12 000rpm離心15min，取離心后上清液裝入新的1.5ml EP管中，置于冰上。樣品變性：根據(jù)EP管中取得的蛋白樣品總體積，加入1/5總體積的5×蛋白loading buffer，充分混勻后，在100℃蜂窩爐煮變性5～10min，最后放在冰上約3min。

1.5 細胞活力檢測（CCK-8）：①根據(jù)實驗設(shè)計將不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激A375黑素瘤細胞24h后，取出培養(yǎng)板;②倒掉培養(yǎng)基，向待檢測孔中加20?l的CCK-8溶液;③將CCK-8溶液處理后的培養(yǎng)板，直接放入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)2h;④采用多功能微孔板檢測儀測定每孔490nm處的吸光度，得到每孔的OD值;⑤測得的每個孔中OD值，制作時間點-活細胞率曲線圖。實驗重復(fù)至少3次。

采用CCK-8分別檢測：順鉑（10mg/ml）處理A375黑素瘤細胞0h、24h、48h、72h的OD值;LY294002（PI3K通路抑制劑）預(yù)處理黑素瘤細胞A375中1h后聯(lián)用順鉑（10mg/ml）處理0h、24h、48h、72h的OD值;Rap（mTOR通路抑制劑）預(yù)處理黑素瘤細胞A375中1h后聯(lián)用順鉑（10mg/ml）處理0h、24h、48h、72h的OD值;根據(jù)測得的OD值制作時間點-活細胞率曲線圖。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：所有結(jié)果均采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2? 結(jié)果

2.1 順鉑誘導(dǎo)黑素瘤A375細胞凋亡具有濃度和時間依賴性：為研究黑素瘤A375細胞在不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激24h下的凋亡情況，筆者采用Western blot檢測不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）刺激下黑素瘤A375細胞PARP的活化剪切體表達，發(fā)現(xiàn)隨著順鉑濃度的增加，剪切的PARP表達增加，這說明細胞凋亡增加（圖1A）。與此同時，用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞12h、24h、36h，結(jié)果顯示隨著時間的推移，PARP的活化剪切體表達水平增加，說明順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡隨著時間的推移而增加（圖1B）。 此外，為了進一步驗證順鉑對黑素瘤A375具有抑制作用，采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度順鉑（0、5、10、20mg/ml）處理黑素瘤24h后的細胞活性影響，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，細胞活性減弱，這提示細胞凋亡（圖1C）。同時采用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞0h、24h、48h、72h，結(jié)果提示隨著時間的推移，細胞活力也減弱（圖1D）。這些進一步論證順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡隨著時間的推移而增加。

2.2 順鉑誘導(dǎo)黑素瘤A375細胞PI3K/AKT/mTOR通路的活化：為研究順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞在不同時間點（12h、24h）后的PI3K/AKT/mTOR通路的影響，筆者通過Western blot檢測黑素瘤A375細胞在順鉑（10mg/ml）處理12h、24h后，p-AKT（S473） 、p-P70S6K均表達上調(diào)。說明順鉑誘導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR通路的活化，見圖2。

2.3 抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑在黑素瘤A375細胞中誘導(dǎo)的細胞凋亡：為了研究PI3K/AKT/mTOR通路在順鉑誘導(dǎo)黑素瘤A375細胞的細胞凋亡中的作用，采用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理1h阻斷PI3K/AKT通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞24h，36h，Western blot結(jié)果顯示，預(yù)處理后聯(lián)用順鉑組與順鉑組相比，PARP蛋白的活化剪切表達量明顯上調(diào)，說明阻斷PI3K/AKT增強順鉑誘導(dǎo)的細胞死亡。（圖3）。與此同時，用mTOR的抑制劑Rap預(yù)處理1h阻斷mTOR通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞24h，36h，Western blot結(jié)果顯示，預(yù)處理后聯(lián)用順鉑組與順鉑組相比PARP蛋白的活化剪切表達量明顯上調(diào)。

此外，為了進一步驗證PI3K/AKT/mTOR通路在順鉑誘導(dǎo)黑素瘤A375細胞的細胞凋亡中的作用，采用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理1h阻斷PI3K/AKT通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞0h、24h，48h、72h，CCK-8結(jié)果顯示預(yù)處理后聯(lián)用順鉑組與順鉑組相比，細胞的活力明顯減弱（圖3A）。與此同時，用mTOR的抑制劑Rap預(yù)處理1h阻斷mTOR通路后再用順鉑（10mg/ml）處理黑素瘤A375細胞0h、24h，48h、72h，CCK-8結(jié)果顯示預(yù)處理后聯(lián)用順鉑組與順鉑組相比，細胞的活力明顯減弱（圖3B）。總之，抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑在黑素瘤A375細胞中誘導(dǎo)的細胞凋亡。

2.4 抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強了順鉑在黑素瘤A375細胞凋亡，可能與Bcl-2、Bcl-xl表達水平下調(diào)有關(guān);為了研究抑制PI3K/AKT/mTOR通路增強了順鉑在黑素瘤A375細胞凋亡的可能機制，筆者在黑素瘤A375細胞中先用LY294002和Rap分別預(yù)處理1h分別阻斷PI3K/AKT和mTOR通路后，再用順鉑處理24h，36h，Western blot檢測Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達。結(jié)果顯示，LY294002/Rap預(yù)處理聯(lián)用順鉑組與單用順鉑組相比，Bcl-2和Bcl-xl表達量明顯下調(diào)，說明阻斷PI3K/AKT/mTOR通路可能通過下調(diào)Bcl-2和Bcl-xl蛋白增強的順鉑誘導(dǎo)的凋亡，見圖4。

3? 討論

黑素瘤是好發(fā)于皮膚的惡性腫瘤，目前的治療方案有手術(shù)治療、放化療、免疫治療、分子靶向治療等[18-19]。對于藥物化療治療黑素瘤往往缺乏有效的藥物靶點，且對靶向藥物的耐藥性限制了黑素瘤患者長期治療的療效[20]。盡管有報道一些藥物在一定程度上改善了黑素瘤的治療效果，但是黑素瘤對藥物的敏感性下降往往是化療藥物耐藥的關(guān)鍵原因之一，其與PI3K/AKT/mTOR作用于黑素瘤細胞息息相關(guān)[21-24]。本研究證實順鉑在A375黑素瘤細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡，實驗在不同濃度順鉑處理下PARP的活化剪切表達隨著濃度的增加而增加，剪切的parp還隨時間推移而增加;此外，CCK-8細胞活力檢測分析表明隨著順鉑濃度增加和時間的推移A375黑素瘤細胞活力減弱（P<0.05）。這說明順鉑在A375黑素瘤細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡。這與他人報道的順鉑在多種癌細胞中的細胞毒性作用結(jié)論一致[25-26]。本實驗也證實了阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導(dǎo)的A375細胞具有協(xié)同作用，本實驗采用PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑與順鉑聯(lián)合處理A375細胞，與單獨使用順鉑組相比，剪切的PARP蛋白表達量明顯上調(diào)，CCK-8實驗檢測分析細胞活力減弱（P<0.05），這說明阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑誘導(dǎo)A375細胞凋亡[27]。為了進一步探索該協(xié)同作用的機制，采用PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑與順鉑聯(lián)合處理A375細胞后檢測Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達，發(fā)現(xiàn)Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達明顯下調(diào)。因此推測阻斷PI3K/AKT/mTOR通路對順鉑誘導(dǎo)細胞凋亡中的協(xié)同作用可能與Bcl-2和Bcl-xl下調(diào)有關(guān)。

本研究揭示了阻斷PI3K/AKT/mTOR對順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡具有協(xié)同作用，這種保護作用可能與Bcl-2和Bcl-xl蛋白下調(diào)有關(guān)。

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[收稿日期]2019-01-03

本文引用格式：張斌斌，王湘琦，趙超然，等.阻斷PI3K/AKT/mTOR通路增強順鉑誘導(dǎo)的人皮膚黑素瘤細胞株A375凋亡的機制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（8）：72-76.