于鐘鈺， 張曉明， 王劍濤， 溫小紅， 徐曉蝶， 郭景春， 周厚廣*

1. 復旦大學附屬華山醫(yī)院老年醫(yī)學科，國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海 200040 2. 復旦大學神經(jīng)生物學國家重點實驗室，上海 200032

近年來，隨著經(jīng)濟水平和人們預期壽命的不斷提高，中國已進入了人口老齡化的加速期。近期發(fā)布的《老年健康藍皮書：中國老年健康研究報告(2018)》顯示，2000至2018年，我國60歲及以上老年人口從1.26億人增加到2.49億人，占總人口比重從10.2%上升到17.9%。老齡化的加劇導致心腦血管疾病的發(fā)病率顯著升高[1-2]，而老年人心腦血管病變的病理基礎主要是動脈粥樣硬化。發(fā)生動脈粥樣硬化的危險因素眾多[3-6]，如2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)、高血壓病、血脂異常、肥胖、高同型半胱氨酸等，其中T2DM是最重要的獨立危險因素。T2DM患者體內(nèi)存在糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗和炎癥反應，這些刺激可引起動脈粥樣硬化，促進血管病變的發(fā)生發(fā)展[7]。

研究[8]表明，氧化應激反應是動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的關鍵步驟。碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)是一種廣泛存在的含鋅金屬蛋白酶，同時也是一種pH調節(jié)蛋白，其中CAⅢ是該家族的特殊成員[9]。CAⅢ在人體的骨骼肌和肝臟組織中表達豐富，且可以保護細胞免受氧化應激的損傷[10-11]。因此，本研究擬進一步探討血清CAⅢ水平與老年T2DM患者血管并發(fā)癥的相關性，為老年人T2DM性血管病變的診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年復旦大學附屬華山醫(yī)院老年病科體檢人員，詳細詢問并記錄所有入組者年齡、性別、既往病史等。既往史包括：有無高血壓病、T2DM、冠心病、高血脂、心絞痛、心肌梗死、腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作等。根據(jù)2010年版美國糖尿病學會(ADA)糖尿病診斷標準篩選符合標準的T2DM患者，共246例。記錄患者有無血管性疾病，包括腦血管疾病(腦梗死/腦小血管病/腦出血等)、冠心病、頸動脈粥樣硬化。據(jù)此，將T2DM患者分為有血管并發(fā)癥組(n=87)和無血管并發(fā)癥組(n=159)。篩選同期56例健康老年人作為對照組。因此，本研究共有3組研究對象：對照組、T2DM未合并血管并發(fā)癥組和T2DM合并血管并發(fā)癥組。

排除標準：T2DM以外的其他類型糖尿病患者或繼發(fā)性糖尿病患者；T2DM合并急性并發(fā)癥，如酮癥酸中毒、高滲性昏迷、低血糖；合并其他內(nèi)分泌代謝疾病，如甲狀腺功能亢進或減退、腎上腺皮質功能不全、垂體瘤等；免疫相關血管性疾?。蛔陨砻庖咝约膊?、急慢性感染、艾滋病、梅毒、肝硬化、腎功能衰竭、惡性腫瘤、圍手術期、有精神病史等患者。對照組入組標準：無上述常見老年慢性疾病，同時無以上排除標準中各種疾病。本研究通過復旦大學附屬華山醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法 比較對照組和T2DM組患者的血清生化指標。比較T2DM是否伴發(fā)血管并發(fā)癥兩組患者的基本數(shù)據(jù)(包括年齡、高血壓、高脂血癥、心房顫動/房撲、左束支傳導阻滯)以及血清標志物水平。為研究血清CAⅢ水平與T2DM合并血管并發(fā)癥間是否存在相關性，ELISA法檢測3組患者血清CAⅢ水平，采用Spearman相關系數(shù)分析CAⅢ水平與血清生化指標之間的相關性，同時采用ROC曲線評價血清CAⅢ水平對診斷T2DM血管并發(fā)癥的臨床應用價值。

1.3 生化指標 受檢者清晨空腹(至少8 h內(nèi)未進食)，采集靜脈血5 mL，生化指標檢測采用全自動生化分析儀，包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿酸(UA)、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)，檢測嚴格遵守《全國臨床檢驗操作規(guī)范》規(guī)定。

1.4 血清CAⅢ水平檢測 收集3組受檢者的血清。采用ELISA試劑盒檢測各組血清中CAⅢ水平。首先在試劑盒中取標準品1支，離心機中使用6 000 r/min離心30 s，然后用1 mL樣本稀釋液溶解，完全混勻后得標準品S7。標記7個1.5 mL離心管依次排列，編號為S0～6，每個離心管中加入250 μL樣本稀釋液，然后吸取250 μL S7內(nèi)標準品，放入第一個離心管S6中，將S6混勻后吸取出250 μL溶液放入第2個離心管S5中，如此依次進行標準品的稀釋，S0離心管中加入樣本稀釋液。依照以上步驟將標準品稀釋為500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 ng/mL。然后，標記標準品孔和待測樣本孔，每孔中分別加入標準品或待測樣本100 μL,混勻后蓋上板貼，使用37℃溫箱孵育2 h。棄去液體，甩干。加入生物素標記抗體工作液100 μL，蓋上板貼，37℃溫箱孵育1 h。棄去液體，甩干，洗板2 min×3次，每孔200 μL，甩干。加入辣根過氧化物酶標記親和素液100 μL，蓋上板貼，37℃溫箱孵育1 h。棄去液體，甩干，洗板2 min×5次，每孔200 μL，甩干。每孔內(nèi)加入90 μL底物溶液，37℃避光顯色15～30 min。之后，每孔加入50 μL終止溶液，使反應終止。檢測450 nm波長的光密度(D)值。最后，利用標準曲線計算出各個樣品中的CAⅢ水平。

2 結 果

2.1 一般資料的比較 結果(表1)表明，與對照組相比，T2DM組患者血清中ALT、TP、ALB、BUN、UA、TG、LDL、FBG、HbA1c水平均增加，同時血清中HDL水平降低，差異有統(tǒng)計學意義。結果表明，T2DM患者體內(nèi)普遍存在糖脂穩(wěn)態(tài)失衡。本研究中，T2DM患者中血管并發(fā)癥的發(fā)生率為35.37%，其中冠心病的發(fā)生率最高，為28.86%；合并腦血管疾病的發(fā)生率為11.38%；合并頸動脈粥樣硬化的發(fā)生率為4.47%。

2.2 有/無血管并發(fā)癥T2DM患者間的基本資料和生化指標比較 結果(表2)表明，與無血管并發(fā)癥組相比，有血管并發(fā)癥組的高血壓、高脂血癥、心房顫動/房撲以及左束支傳導阻滯的發(fā)生比例較高，且年齡和高血壓兩因素差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明，T2DM伴血管并發(fā)癥患者患有高血壓、高脂血癥、心房顫動/房撲、左束支傳導阻滯的概率較大，遠期并發(fā)癥風險較高。

表1 對照組和T2DM組患者生化指標比較

*P<0.05，**P<0.01. 谷丙轉氨酶(ALT)；谷草轉氨酶(AST)；谷氨酰轉移酶(GGT)；堿性磷酸酶(ALP)；總膽紅素(TBIL)；直接膽紅素(DBIL)；總蛋白(TP)；白蛋白(ALB)；尿素氮(BUN)；肌酐(Scr)；尿酸(UA)；膽固醇(TC)；三酰甘油(TG)；低密度脂蛋白(LDL)；高密度脂蛋白(HDL)；空腹血糖(FBG)；糖化血紅蛋白(HbA1c)

血清生化指標的檢測結果(表3)表明：與無血管并發(fā)癥組相比，有血管并發(fā)癥組患者的血清TBIL水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但其余生化指標均無顯著性差異。T2DM患者體內(nèi)普遍存在糖脂穩(wěn)態(tài)失衡，各種血清生化指標均可出現(xiàn)異常，但目前常見的血清生化指標并不能用來評估T2DM患者有無血管并發(fā)癥。

表2 有/無血管并發(fā)癥T2DM患者間基本資料比較 n(%)

表3 有/無血管并發(fā)癥T2DM患者間血清生化指標(95%CI)的比較

谷丙轉氨酶(ALT)；谷草轉氨酶(AST)；谷氨酰轉移酶(GGT)；堿性磷酸酶(ALP)；總膽紅素(TBIL)；直接膽紅素(DBIL)；總蛋白(TP)；白蛋白(ALB)；尿素氮(BUN)；肌酐(Scr)；尿酸(UA)；膽固醇(TC)；三酰甘油(TG)；低密度脂蛋白(LDL)；高密度脂蛋白(HDL)；空腹血糖(FBG)；糖化血紅蛋白(HbA1c)

2.3 不同組別血清CAⅢ水平的比較 ELISA法分別檢測了3組人群血清中CAⅢ水平(圖1)，結果提示，3組間CAⅢ水平差異有統(tǒng)計學意義，其中，與對照組(1.05±0.108)相比，兩個T2DM組血清CAⅢ水平均明顯降低(P<0.01)。同時，T2DM合并血管并發(fā)癥組血清CAⅢ水平(0.82±0.113)顯著低于T2DM未合并血管并發(fā)癥組(0.97±0.131，P<0.01)。

2.4 血清CAⅢ水平與各生化指標之間相關性分析 結果(表4)表明，血清CAⅢ水平與HDL和TBIL正相關，而與LDL和Scr負相關，但均無顯著統(tǒng)計學差異，不排除樣本量較小所致可能。血清CAⅢ水平與BUN、FBG、HbA1c負相關，差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示血清CAⅢ水平與BUN、FBG和HbA1c間的關聯(lián)性較大。

圖1 3組患者血清CAⅢ水平的比較

**P<0.01，T2DM未合并血管并發(fā)癥組/T2DM合并血管并發(fā)癥組與對照組相比；&&P<0.01，T2DM未合并血管并發(fā)癥組與T2DM合并血管并發(fā)癥組相比

表4 血清CAⅢ水平與各生化指標之間Spearman相關性分析

HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；TBIL:總膽紅素;Scr：肌酐；FBG：空腹血糖；HbA1c：糖化血紅蛋白

2.5 血清CAⅢ水平對診斷T2DM合并血管并發(fā)癥的臨床應用價值 通過比較ROC曲線(圖2)下面積AUC大小判斷各指標對T2DM合并血管并發(fā)癥的臨床診斷準確性。分析結果(表5)顯示，LDL的AUC為0.507 8(95%CI 0.390 9～0.624 6，P=0.896 9)，HDL的AUC為0.531 7(95%CI 0.423 2～0.640 3，P=0.566 0)，TBIL的AUC為0.557 3(95%CI 0.451 5～0.663，P=0.291 8)，CAⅢ的AUC為0.884 6(95%CI 0.813 2～0.956，P<0.000 1)。結果(表5)顯示，血清CAⅢ的ROC曲線下面積AUC為0.884 6，診斷準確性優(yōu)于其他3項常規(guī)指標，提示血清CAⅢ對T2DM合并血管并發(fā)癥具有較好的臨床診斷敏感性和特異性。

圖2 各生化指標的ROC曲線

項目AUC面積約登指數(shù)靈敏度(%)特異度(%)LDL0.507 823.6423.64100HDL0.531 715.6128.5787.04TBIL0.557 313.5592.8620.69CAⅢ0.884 669.5483.3386.21

3 討 論

伴隨著我國進入深度老齡化社會，心腦血管疾病已嚴重威脅老年人群的身體健康和生活質量。動脈粥樣硬化是老年人心腦血管疾病的主要病理基礎。T2DM、高血壓病、高脂血癥、吸煙、肥胖和非酒精性脂肪肝等是動脈粥樣硬化的常見危險因素，其他還包括高尿酸血癥、高同型半胱氨酸血癥、不健康的飲食習慣、家族史等。中國T2DM的發(fā)病率逐年增加，是老年人群中最常見的慢性疾病，同時T2DM引起的血管病變嚴重影響老年人的預期壽命。雖然以往相關研究認為T2DM引起的動脈粥樣硬化病變過程中有氧化應激、炎癥反應、內(nèi)皮細胞功能障礙等多種相關機制的參與其中，但具體分子機制尚未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)，無論T2DM患者有無血管并發(fā)癥，體內(nèi)CAⅢ水平與對照組相比均顯著降低，同時T2DM合并血管并發(fā)癥患者血清中CAⅢ水平低于T2DM未合并血管并發(fā)癥患者，提示血清CAⅢ水平可能與T2DM及其相關血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展存在內(nèi)在聯(lián)系。

T2DM患者體內(nèi)長期存在高血糖和胰島素抵抗，在多種代謝紊亂的病理生理因素刺激下，通過增強氧化應激，引起血管內(nèi)皮損傷，炎癥因子和黏附分子表達增加，致炎細胞向動脈內(nèi)膜遷移并黏附。血管內(nèi)巨噬細胞通過吞噬LDL，形成泡沫細胞，最終促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[12]。研究表明，在氧化應激狀態(tài)下肝細胞內(nèi)CAⅢ表面的兩個半胱氨酸殘基會迅速結合形成S-谷胱甘肽[13]；暴露在H2O2的細胞轉染CAⅢ后，活性氧(ROS)水平較未轉染組明顯減少[14]，提示CAⅢ可能具有抗氧化應激作用。在本臨床試驗中，T2DM合并血管并發(fā)癥患者血清CAⅢ水平明顯低于對照組和T2DM未合并血管并發(fā)癥組，提示CAⅢ水平下降有可能參與了T2DM患者體內(nèi)的氧化應激，從而促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展進程。同時，除了作為一個特殊的體內(nèi)抗氧化應激因子，CAⅢ還是一種pH敏感型的蛋白酶，在胰島素抵抗和高血糖作用下，可造成細胞內(nèi)乳酸生成增多，pH值下降，進而抑制CAⅢ的表達，同時抑制O2與血紅蛋白結合，導致HbA1c增多，氧合血紅蛋白減少[15]，使組織出現(xiàn)缺氧，導致氧化應激反應增強，引起血管內(nèi)皮損傷，進而誘導動脈粥樣硬化的進展。

此外，T2DM患者常伴隨肥胖和高脂血癥，血液中LDL水平增高和HDL水平降低會增加泡沫細胞的形成[16]，引起血液黏度增加和血流動力學變化，進而損傷動脈管壁，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展進程[17]。以往相關研究表明，胰島素可促進脂肪組織的從頭合成，而CAⅢ則主要是為此過程提供碳酸氫根離子[18-19]。T2DM患者體內(nèi)CAⅢ水平低下可能會加重脂代謝紊亂，從而導致血管并發(fā)癥的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與56例正常老年對照組相比，248例老年T2DM患者血液中LDL水平明顯增高，而HDL水平則顯著降低，提示臨床老年T2DM患者確實存在明顯的脂代謝紊亂，與上述報道結果基本一致。

本研究中Spearman相關性分析顯示血清中TBIL水平與CAⅢ正相關，而且TBIL水平在T2DM有無血管并發(fā)癥患者中存在明顯差異，即合并血管并發(fā)癥T2DM患者的TBIL水平明顯低于無血管并發(fā)癥T2DM患者。臨床上普遍認為膽紅素作為一種有害物質，主要用來評估肝功能和黃疸。其實膽紅素同時也是一種內(nèi)源性抗氧化劑[20]，可以參與抗氧化、抗炎癥、抑制細胞凋亡、改善氧化應激等的生理反應[21]。研究表明缺血性腦卒中患者血清膽紅素水平偏低，而相對較高的膽紅素水平可能有助于避免腦梗死的發(fā)生[22]。因此，血清總膽紅素水平過低有可能是誘發(fā)老年人血管病變的危險因素之一。由于血清CAⅢ和TBIL水平均與機體氧化應激水平相關，提示兩者之間可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，共同參與T2DM相關氧化應激障礙和血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展進程，適當提升或補充CAⅢ和TBIL水平可能有助于預防或延緩T2DM相關血管并發(fā)癥。但其內(nèi)在機制尚待進一步研究和明確。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血清CAⅢ水平還與BUN和Scr呈一定負相關性，并與BUN呈顯著負相關，提示血清CAⅢ水平與BUN等腎功能相關指標存在一定內(nèi)在關聯(lián)性。長期高血糖可造成腎臟血流動力學紊亂和葡萄糖代謝異常，激活機體內(nèi)氧化應激反應[23-24]，而CAⅢ水平適度升高可使細胞免受氧化應激損傷[25]，同時氧化應激反應可增強CAⅢ蛋白質氧化，氧化的蛋白質隨之被泛素化而降解。因此，我們推測腎功能水平可影響血清CAⅢ水平，而適度提升CAⅢ水平和活性可能有助于在一定程度上保護腎功能。

綜上所述，老年T2DM患者血清CAⅢ水平與糖脂代謝穩(wěn)態(tài)之間存在密切相關性，并與腎功能和TBIL水平存在一定內(nèi)在聯(lián)系。ROC曲線分析提示血清CAⅢ水平與T2DM血管并發(fā)癥之間存在內(nèi)在關系，對T2DM合并血管并發(fā)癥具有良好的臨床診斷參考價值。結果提示血清CAⅢ可能是通過調控糖脂代謝穩(wěn)態(tài)等機制來發(fā)揮其重要的生物學效應，低水平的血清CAⅢ可能與TBIL共同參與了T2DM相關氧化應激和血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展進程。適度提升或補充CAⅢ可能有助于預防或延緩老年T2DM相關血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。但目前上述作用機制尚不清楚，仍需大量臨床觀察和深入研究來闡明和揭示CAⅢ參與老年T2DM性血管病變的病理和分子機制，進而為老年T2DM性血管并發(fā)癥的機制研究和臨床干預提供新的思路。