環(huán)狀RNA分子circ_0007766通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1/CyclinE1/CDK4的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖

張帥 夏文佳 董高超 徐維章 李明 許林

近年來肺腺癌發(fā)病率逐步升高[1]，靶向藥物成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的先鋒，諸如表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因突變患者取得了較好的臨床效果，但突變?nèi)巳宏?yáng)性率偏低，患者總體5年生存率仍徘徊在20%，表明肺腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為及分子調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜。隨著ENCODE計(jì)劃的不斷深入，極大地豐富了人們對(duì)于遺傳信息網(wǎng)絡(luò)的理解，讓研究者們能更高效地了解細(xì)胞間相互調(diào)控的分子機(jī)制。circRNA作為非編碼RNA家族中新興成員之一，已經(jīng)被證明在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[2,3]。

本研究前期通過芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織和癌旁組織中circ_0007766表達(dá)呈顯著差異[4]，并在多個(gè)肺腺癌細(xì)胞株中進(jìn)行體外驗(yàn)證，對(duì)circ_0007766在肺腺癌細(xì)胞的增殖、周期和凋亡等生物學(xué)功能進(jìn)行體外水平研究和初步機(jī)制探索。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 肺腺癌A549、SPCA-1、H1975及H1299細(xì)胞系均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)研究所，人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)Sciencell公司。RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol、siRNA和PARISTMKit核漿分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒均購(gòu)自南京凱基公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自上海貝博公司；SYBR Premix Ex Taq qPCR試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連Takara公司；CDK4、cyclin D1、cyclin E、p21和β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基傳代，具體配方為：RPMI-1640加入10%胎牛血清，100 U/mL青霉素以及100 mg/L鏈霉素。人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基傳代，具體配方：DMEM培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清，100 U/mL青霉素以及100 mg/L鏈霉素。培養(yǎng)箱條件設(shè)定為：溫度37 ℃，5%CO2；每2天-3天更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞傳代條件為匯合度大于3/4。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，約3,000個(gè)細(xì)胞/孔/100 μL。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2）。每孔加入10 μL CCK8檢測(cè)試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，并測(cè)定各孔的OD值。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 胰酶消化、離心后收集細(xì)胞，以預(yù)冷的無水乙醇（乙醇終濃度70%），吹打混勻，4 ℃固定過夜。離心并收集固定后的細(xì)胞，加入RNaseA于37 ℃水浴，最后加入PI常溫下避光染色30 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用 ModFit分析細(xì)胞周期分布。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 胰酶消化、離心后收集細(xì)胞，在EP管中加入300 μL的1×Binding Buffer，制成單細(xì)胞懸液待標(biāo)記檢測(cè)，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，置于避光環(huán)境下室溫孵育15 min，再加入5 μL的PI染色標(biāo)記懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn) 用標(biāo)記筆在6孔板背后用直尺均勻地劃?rùn)M線，大約每隔1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。每孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，過夜后保證能鋪滿90%以上，第2天用移液槍頭按照之前背面畫的橫線個(gè)盡量垂直在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)劃痕，用PBS漂洗細(xì)胞2次-3次，清除劃掉的貼壁細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，取樣觀察、拍照。

1.7 Real-time PCR檢測(cè) 細(xì)胞總RNA采用Ttrzol試劑進(jìn)行提取，分光分度儀測(cè)定總RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參，ABI7500熒光定量PCR儀上SYBR Green I染料檢測(cè)各基因的表達(dá)情況。

1.8 RIP實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，每管加入磁珠懸液以及RIP沖洗液，vortex旋震蕩。磁力分選后，棄去上清。RIP沖洗液重懸磁珠，加入配對(duì)抗體，室溫靜置30 min。磁力分選，棄上清。加入RIP緩沖液，離心免疫沉淀的小管，再次進(jìn)行磁力分選，棄去上清。加入RIP沖洗液，vortex渦旋震蕩后再次磁力分選，棄去上清。蛋白酶K緩沖液重懸上述磁珠-抗體復(fù)合物。孵育后將微管置于磁力架上，將上清液吸入一新的微管中，加入RIP緩沖液。每管加入苯酚、氯仿、異戊醇，vortex震蕩后離心。吸取上層水相至新EP管中，加入氯仿，震蕩后離心，吸取上層水相后移入新EP管中，加入鹽溶液I、鹽溶液II、沉淀增強(qiáng)劑、RNA-free無水乙醇后混合，-80 ℃過夜。離心后棄去上清，80%乙醇沖洗一次，再次離心后棄去上清，通風(fēng)櫥中晾干。RNA-free水重懸，用于逆轉(zhuǎn)錄以及qPCR分析。

1.9 Western blot蛋白印跡 胰酶消化、離心后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和蛋白膜抑制劑，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法定量，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用10%脫脂奶粉封閉，一次孵育一抗、二抗后，用Odyssey近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析方法 數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）計(jì)量，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。多組間變量資料比較采用ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組間變量資料比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 常見肺腺癌細(xì)胞和臨床樣本中circ_0007766的表達(dá)情況 如圖1所示，通過qPCR檢測(cè)，我們?cè)诜蜗侔┏Ｓ?株細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)circ_0007766的表達(dá)，其表達(dá)水平均顯著高于人支氣管上皮樣細(xì)胞BEAS-2B中circ_0007766的表達(dá)，提示circ_0007766在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)具有普遍性。體外實(shí)驗(yàn)以circ_0007766表達(dá)水平最高的SPCA-1細(xì)胞（平均上調(diào)4.2倍，P＜0.01）和肺腺癌細(xì)胞A549為研究對(duì)象進(jìn)行研究。此外，我們隨機(jī)從江蘇省腫瘤醫(yī)院生物樣本庫(kù)中挑選了30例肺腺癌組織樣本，進(jìn)行qPCR的驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中circ_0007766在肺腺癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，平均上調(diào)2.76倍，差異表達(dá)水平顯著（P＜0.05）。

2.2 circ_0007766可以促進(jìn)SPCA-1和A549細(xì)胞的增殖能力 采用siRNA干擾SPCA-1和A549細(xì)胞中circ_0007766的表達(dá)，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)研究其增殖能力的變化。分別檢測(cè)0 h，24 h，48 h，72 h和96 h的OD值，如圖2所示。相比較于NC組，轉(zhuǎn)染si_circ_0007766后SPCA-1和A549細(xì)胞中增殖速率均顯著降低。上述結(jié)果表明降低circ_0007766的表達(dá)對(duì)SPCA-1和A549細(xì)胞的增殖具有抑制的作用。

圖1 常見肺腺癌細(xì)胞系和臨床樣本中circ_0007766的表達(dá)水平。A：qPCR檢測(cè)細(xì)胞系中內(nèi)源性circ_0007766的表達(dá)情況，以正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B為對(duì)照。（*P＜0.05，**P＜0.01）；B：在30例隨機(jī)挑選的肺腺癌組織樣本中進(jìn)行qPCR的驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ_0007766差異表達(dá)顯著，相較于癌旁組織平均上調(diào)2.76倍（P＜0.05）。Fig 1 The expression level of circ_0007766 in common lung adenocarcinoma cell lines and clinical samples.A: The expression of endogenous circ_0007766 detected in normal bronchial epithelial cells BEAS-2B was detected as control (*P＜0.05, **P＜0.01); B: The results of qPCR in 30 randomly selected lung adenocarcinoma tissues showed that circ_0007766 was significantly different in expression, which was 2.76 times higher than that in adjacent tissues (P＜0.05).

圖2 circ_0007766對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h及96 h時(shí)的細(xì)胞活力。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，并測(cè)定各孔的OD值。Fig 2 Effect of circ_0007766 on cell proliferation of lung adenocarcinoma cell lines.CCK8 assay was carried out to detect the cell viability of cells transfected by siRNA for 0 h, 24 h, 48 h, 72 h and 96 h.Five compound pores were set in each group.The absorbance at 450 nm was measured by enzyme labeling instrument, and the OD value of each pore was determined.

圖3 細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析。A：細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SPAC-1和A549細(xì)胞遷移的能力；B：相較于siRNA對(duì)照組，轉(zhuǎn)染circ_0007766的siRNA后細(xì)胞劃痕修復(fù)能力下降（*P＜0.05）。Fig 3 The cell scratch repair experiment and statistical analysis.A: The cell scratch repair experiment were used to measure cell migration capacity of SPAC-1 and A549 cells; B: The ability of cell scratch repair after transfection of siRNA of circ_0007766 decreases compared with siRNA control group (*P＜0.05).

2.3 circ_0007766可以促進(jìn)SPCA-1和A549細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力 SPCA-1和A549細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA沉默circ_0007766后，采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究其遷移運(yùn)動(dòng)能力是否受到影響。分別觀察0 h、12 h和24 h的細(xì)胞劃痕修復(fù)情況（圖3），結(jié)果按照劃痕兩側(cè)細(xì)胞結(jié)合度百分比計(jì)算，相比較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染si_circ_0007766約24 h后SPCA-1和A549細(xì)胞劃痕修復(fù)能力顯著降低。上述結(jié)果表明降低circ_0007766的表達(dá)可以抑制SPCA-1和A549細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力。

圖4 circ_0007766對(duì)SPCA-1和A549細(xì)胞周期的影響及統(tǒng)計(jì)分析。A：各組細(xì)胞固定后加入PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。分析時(shí)使用FL2-w和FL2-A模式；B：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞受阻于G0/G1期，該期細(xì)胞比例顯著升高（*P＜0.05, **P＜0.01）。Fig 4 Effect of circ_0007766 on cell cycle of SPCA-1 and A549 cells and statistical analysis.A: Cells in each group were fixed and stained with PI.Flow cytometry was used to detect the cell cycle; B: The results were analyzed by cell cycle simulation software ModFit.FL2-w and FL2-A patterns were used.Cells in the experimental group were arrested in G0/G1 phase, and the proportion of cells in this phase was significantly increased(*P＜0.05, **P＜0.01).

2.4 circ_0007766對(duì)SPCA-1和A549細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響 SPCA-1和A549細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA沉默circ_0007766后，采用PI單染方法檢測(cè)細(xì)胞周期分布的影響（圖4）。相比較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染si_circ_0007766約48 h后SPCA-1和A549細(xì)胞G0期/G1期周期比例明顯增多。上述結(jié)果表明沉默circ_0007766后的SPCA-1和A549細(xì)胞受阻于G0期/G1期。

2.5 circ_0007766對(duì)SPCA-1和A549細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V-FITC雙染標(biāo)記進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（圖5），相比較于NC組，轉(zhuǎn)染si_circ_0007766后SPCA-1和A549細(xì)胞的凋亡比例并無顯著差異。

2.6 circ_0007766并非通過調(diào)控親本基因ERBB2的表達(dá)發(fā)揮作用 通過circBase網(wǎng)站（http：//www.circbase.org/）、UCSC （http：//genome.ucsc.edu/）等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索表明circ_0007766由ERBB2基因的6號(hào)-10號(hào)外顯子環(huán)化形成，剪切長(zhǎng)度為676 bp，屬于外顯子來源circRNA。ERBB2又名Her2，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，作為一種原癌基因其在細(xì)胞表面高表達(dá)代表腫瘤惡性程度更高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。我們推測(cè)circ_0007766可能通過順式作用調(diào)控其親本基因ERBB2發(fā)揮作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，沉默circ_0007766后SPCA-1細(xì)胞中ERBB2的mRNA及蛋白表達(dá)均無顯著變化（圖6）。

圖5 circ_0007766對(duì)SPCA-1和A549細(xì)胞凋亡的影響及統(tǒng)計(jì)分析。A：各組細(xì)胞接受AnnexinV和PI染色后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例；B：相較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染si_circ_0007766后SPCA-1和A549細(xì)胞的凋亡比例并無顯著差異。Fig 5 Effect of circ_0007766 on apoptosis of SPCA-1 and A549 cells and statistical analysis.A: The percentage of apoptotic cells was detected by flow cytometry after AnnexinV and PI staining; B:Compared with the control group, there was no significant difference in the percentage of apoptotic cells of SPCA-1 and A549 after transfection of si_circ_0007766.

2.7 circ_0007766顯著下調(diào)Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的mRNA表達(dá) 由于沉默circ_0007766表達(dá)后肺腺癌細(xì)胞增殖受阻，細(xì)胞周期受阻于G0期/G1期，為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們以體外circ_0007766表達(dá)豐度最高的SPCA-1細(xì)胞為模板，沉默circ_0007766表達(dá)后SPCA-1細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E1及CDK4 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而P21基因mRNA表達(dá)無顯著變化（圖7）。

2.8 circ_0007766與eIF4A3蛋白具有結(jié)合能力 eIF4A3蛋白是真核生物延長(zhǎng)翻譯因子家族成員之一，作為一種RNA結(jié)合蛋白可與靶mRNA結(jié)合，并通過無義介導(dǎo)的mRNA降解途徑（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)[5]。我們進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)（https：//circinteractome.nia.nih.gov），發(fā)現(xiàn)circ_0007766與eIF4A3蛋白有多達(dá)8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。于是我們進(jìn)一步進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證circ_0007766與eIF4A3蛋白具有結(jié)合能力（圖8）。

2.9 circ_0007766可能通過影響eIF4A3下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1，Cyclin E1及CDK4的表達(dá) 文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)腸癌中細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白Cyclin D1、Cyclin E1及CDK4是eIF4A3的下游靶標(biāo)[6]，在肺腺癌中是否具有類似機(jī)制尚不得而知。在沉默circ_0007766表達(dá)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表達(dá)明顯下調(diào)，而對(duì)P21蛋白的表達(dá)無顯著影響。我們結(jié)合生物信息學(xué)分析并推測(cè)，circ_0007766可能通過結(jié)合eIF4A3蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控肺腺癌增殖。在沉默eIF4A3蛋白表達(dá)后下游靶基因Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表達(dá)效應(yīng)可以通過沉默circ_0007766得到部分逆轉(zhuǎn)，而P21蛋白無顯著變化（圖9）。以上結(jié)果表明，circ_0007766可能是通過招募eIF4A3蛋白調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表達(dá)。

3 討論

circRNA是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。circRNA通常由宿主基因外顯子或內(nèi)含子剪切環(huán)化而成；由于其在結(jié)構(gòu)上封閉成環(huán)，對(duì)RNA酶不敏感，因而較線性RNA更穩(wěn)定，具備理想腫瘤標(biāo)志物的天然優(yōu)勢(shì)[7]。越來越多的證據(jù)表明circRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為我們提供了理解腫瘤生物學(xué)特征的新視角。目前肺腺癌相關(guān)circRNA的研究處于起步階段，我們通過體外沉默circ_0007766表達(dá)的技術(shù)，針對(duì)SPCA-1和A549細(xì)胞設(shè)計(jì)特異性的siRNA，觀察并驗(yàn)證si_circ_0007766的體外效應(yīng)。另外，為觀察circ_0007766對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，我們通過CCK8和PI單染、實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示沉默circ_0007766表達(dá)后肺腺癌細(xì)胞增殖能力顯著下降，細(xì)胞周期受阻于G0/G1期。

細(xì)胞凋亡與壞死不同，細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等過程；是腫瘤細(xì)胞為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[8]。為研究circ_0007766對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡功能的影響，我們利用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果表明沉默circ_0007766表達(dá)后的肺腺癌細(xì)胞凋亡并未有顯著變化。綜上所述，我們研究認(rèn)為circ_0007766主要通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖參與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展，是一種潛在的“促癌因子”。

在探索circ_0007766的機(jī)制研究中，我們通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前外顯子circRNA主要通過三種機(jī)制來調(diào)控基因表達(dá)[9,10]：①調(diào)控親本基因；②ceRNA機(jī)制；③競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白調(diào)控靶基因。通過進(jìn)一步的研究，我們發(fā)現(xiàn)circ_0007766可能是通過結(jié)合蛋白調(diào)控靶基因的方式發(fā)揮生物學(xué)作用。

圖6 circ_0007766沉默后肺腺癌細(xì)胞中親本基因ERBB2的表達(dá)。A：circ_0007766由母基因ERBB2的6至10號(hào)外顯子環(huán)化形成，剪切長(zhǎng)度為676 bp，屬于外顯子來源circRNA；B：qPCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中親本基因ERBB2的表達(dá)水平；C：Western blot檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ERBB2蛋白的表達(dá)水平。Fig 6 Expression of ERBB2 in lung adenocarcinoma cells after circ_0007766 silencing.A: Circ_0007766 is formed by cyclization of exons 6 to 10 of the parent gene ERBB2, with a shear length of 676 bp.It belongs to exon-derived circRNA; B: The expression level of ERBB2 was detected by qPCR after siRNA transfection; C: Western blot were used to detect the expression of ERBB2 protein in siRNA transfected cells.

圖7 細(xì)胞周期關(guān)鍵基因Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4 mRNA表達(dá)（*P＜0.05，**P＜0.01）。Fig 7 mRNA expression of key genes of cell cycle including Cyclin D1,Cyclin E1, and CDK4 (*P＜0.05, **P＜0.01).

最近有報(bào)道[11-13]顯示，circRNA可以通過結(jié)合PES1蛋白調(diào)控核糖體成熟和轉(zhuǎn)錄因子FOXO3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯。我們推測(cè)circ_0007766是否具有類似的調(diào)控機(jī)制，遂將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)到circRNA-蛋白結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)這一方向。首先通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)eIF4A3蛋白在circ_0007766能夠結(jié)合的蛋白質(zhì)中結(jié)合位點(diǎn)最多，我們將其作為重點(diǎn)研究對(duì)象。eIF4A3蛋白作為eIF4A真核翻譯起始因子家族成員之一，可與靶mRNA結(jié)合，并通過無義介導(dǎo)的mRNA降解途徑在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)[14,15]。例如eIF4A3可與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵基因CDK4和凋亡相關(guān)基因Bcl-x等癌基因mRNA結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)其表達(dá)從而抑制腫瘤惡性進(jìn)展[6,16]。我們針對(duì)circ_0007766和eIF4A3蛋白進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明circ_0007766可與eIF4A3蛋白結(jié)合。

圖8 circ_0007766與eIF4A3蛋白結(jié)合能力生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及RIP實(shí)驗(yàn)。A：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circ_0007766與eIF4A3蛋白有多達(dá)8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在所有結(jié)合蛋白中結(jié)合位點(diǎn)數(shù)最多；B：以IgG為對(duì)照，qPCR檢測(cè)eIF4A3抗體所結(jié)合的RNA及circ_0007766表達(dá)水平。Fig 8 Bioinformatics Prediction and RIP assay for the binding ability of circ_0007766 to eIF4A3.A: Bioinformatics predictions revealed that circ_0007766 and eIF4A3 had eight binding sites, with the largest number of binding sites among all binding proteins; B: Using IgG as control,qPCR was used to detect the expression level of RNA and circ_0007766 bound by eIF4A3 antibody.

圖9 沉默circ_0007766和/或eIF4A3后Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的蛋白表達(dá)Fig 9 Protein expression of Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4 in cells silencing circ_0007766 or eIF4A3

在功能學(xué)研究中，我們發(fā)現(xiàn)circ_0007766主要影響肺腺癌細(xì)胞的增殖功能，沉默其表達(dá)后細(xì)胞周期明顯受阻于G0期/G1期，引起該周期相關(guān)蛋白Cyclin D1，Cyclin E1、CDK4及P21表達(dá)顯著下降?；谝陨辖Y(jié)果，我們推測(cè)這種效應(yīng)的結(jié)果是circ_0007766與eIF4A3蛋白介導(dǎo)NMD途徑實(shí)現(xiàn)的。隨后我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一推測(cè)，設(shè)計(jì)circ_0007766與eIF4A3蛋白交叉沉默分組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默circ_0007766表達(dá)引起的周期蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4表達(dá)下降的效應(yīng)可被沉默eIF4A3蛋白所拯救，而對(duì)P21蛋白的表達(dá)影響不大。

綜上所述，本研究從circRNA這一新視角出發(fā)，通過對(duì)肺腺癌與癌旁組織樣本的高通量芯片篩查獲取差異表達(dá)circRNA，結(jié)合臨床病理及隨訪資料發(fā)現(xiàn)circ_0007766與肺腺癌患者TNM分期及預(yù)后呈顯著正相關(guān)。體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默circ_0007766可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期受阻于G0期/G1期。分子機(jī)制研究表明circ_0007766主要通過影響eIF4A3蛋白功能，從而上調(diào)周期蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖。本研究可為肺腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理及預(yù)后判斷提供新線索，為臨床治療應(yīng)用提供新靶標(biāo)。