黃澤凱 李少雷 馬媛媛 吳楠 楊躍

肺癌是全球發(fā)病率最高的癌癥類型，并且是癌癥死亡的主要原因。據(jù)估計2018年全球?qū)⒂?10萬新發(fā)肺癌病例和180萬新發(fā)死亡病例，死亡人數(shù)占癌癥總體死亡人數(shù)的18.4%[1]。在中國，肺癌也是最常見的癌癥類型和癌癥死亡的主要原因。目前最新的文獻顯示2015年中國新發(fā)肺癌病例為73.3萬例，肺癌死亡病例為61.0萬例[2]。肺腺癌是最常見的肺癌亞型，也是非吸煙肺癌患者中最常見的肺癌組織學類型[3]。盡管近些年來由于靶向治療等新的治療方式的飛速發(fā)展使得肺癌的治療取得重大進展，但是由于約70%的患者在診斷為肺癌時就已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉移或為局部晚期，肺癌在美國的總體生存率仍只有18%左右[4]。因此，尋找新的肺癌治療靶標和預后生物標志物顯得尤為重要。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類含有約22個核苷酸的單鏈小非編碼RNA，其通過介導翻譯抑制或促進靶mRNA的降解而作為內(nèi)源基因調(diào)節(jié)劑發(fā)揮重要作用[5]。據(jù)估計微小RNA可以靶向超過30%的人類基因組，而且微小RNA的異常表達已經(jīng)被證實與多種癌癥的發(fā)生密切相關[6]。MiR-148b-3p作為一種重要的微小RNA，已經(jīng)被報道與腎癌、胃癌、乳腺癌等多種癌癥密切相關，但與肺腺癌的關系尚不清楚[7-9]。本研究通過檢測miR-148b-3p在肺腺癌中的表達水平，分析其與臨床病理特征及患者預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象及臨床資料 收集2011年1月-2012年12月之間在我科進行手術切除的肺腺癌患者的腫瘤標本123例。納入本研究的患者均為初診且術前未行放化療等抗腫瘤治療，排除伴其他惡性腫瘤或有既往惡性腫瘤病史的患者。本項研究通過了本院倫理委員會批準并取得患者的知情同意。在123例肺腺癌患者中男性73例，女性50例。年齡范圍為31歲-86歲，其中≥60歲56例，＜60歲67例。腫瘤分化程度為中高分化（G1-2）的腫瘤標本75例，低分化（G3-4）48例。腫瘤大小≥3 cm 63例，＜3 cm 60例。存在淋巴結轉移（node status positive）63例，不存在淋巴結轉移（node status negative）60例。存在遠處轉移（metastasis status positive）11例，不存在遠處轉移（metastasis status negative）112例。未接受術后治療56例；而接收術后治療67例（其中接收單純化療46例，接收單純放療1例，接收單純靶向治療5例；同時接收放化療10例，同時接收放化療和靶向治療2例，同時接收化療和靶向治療2例，同時接收放療和靶向治療1例）。

1.2 MiR-148b-3p表達量的測定及分組 病理組織保存于-80 ℃冰箱中，按照Trizol試劑（Invitrogen, Carlsbad, CA,USA）說明書的方法提取肺腺癌腫瘤組織的總RNA，并使用NanoDrop機器進行RNA定量與質(zhì)檢。本研究使用加尾法逆轉錄microRNA為cDNA。首先使用polyA聚合酶（New England Biolabs, USA）將polyA尾添加到0.5 μg總RNA中，然后使用M-MLV cDNA第一鏈逆轉錄試劑盒（Cat No.C28025032, Invitrogen）將microRNA逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green實時熒光定量PCR方法檢測miR-148b-3p的表達量，并以U6為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計算倍數(shù)變化。實時熒光定量PCR所用的miR-148b-3p上游引物為：5’-TCAGTGCATCACAGAACTTTGT-3’，下游引物為：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’。U6的上游引物為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。此外，根據(jù)miR-148b-3p的相對表達量，借助Cutoff Finder程序[10]確定MiR-148b-3p分組的最佳分界值，該程序可基于對數(shù)秩檢驗（Log-ranktest）計算最佳分界值。

1.3 隨訪 通過電話、郵件、復查等方式進行隨訪，末次隨訪時間為2018年7月12日。在術后的前兩年，患者每3個月隨訪一次；術后3年-5年每6個月隨訪一次；術后5年以后，每年隨訪一次。對有癥狀的患者給予相應的檢查。在隨訪期間，常規(guī)的復查項目包括詳細的病史詢問、體格檢查、胸部CT檢查等?；颊咝g后的不良反應、疾病復發(fā)、死亡等都被詳細記錄。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用IBM SPSS version 24（Chicago, USA）軟件進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗或Fisher精確概率法對兩組計數(shù)資料進行比較?？偵嫫冢╫verall survival, OS）定義為患者從接受手術到死亡或末次隨訪的時間，采用Kaplan-Meier生存分析方法進行估計并且采用Log-rank檢驗方法進行顯著性檢驗。檢驗水準α=0.05。利用單因素和多因素Cox比例風險模型分析影響患者總生存的獨立預測因子。多因素Cox比例風險模型納入的變量為單因素Cox分析中有統(tǒng)計學意義（P＜0.100）的變量。

2 結果

2.1 MiR-148b-3p的相對表達量與肺腺癌患者臨床病理特征的相關性 根據(jù)miR-148b-3p的相對表達量，借助Cutoff Finder程序[10]將123例肺腺癌患者分為71例miR-148b-3p高表達組和52例miR-148b-3p低表達組。MiR-148b-3p表達量與腫瘤的分化程度（P=0.001）、腫瘤大小（P=0.007）顯著相關，而與年齡、性別、吸煙史、飲酒史、脈管癌栓、胸膜侵犯、淋巴結轉移和遠處轉移不存在統(tǒng)計學顯著的相關性，見表1。

2.2 MiR-148b-3p表達量與肺腺癌患者總生存之間關系的Kaplan-Meier生存分析 所有患者的中位隨訪時間是68.0個月（95%CI： 62.9-73.1）。MiR-148b-3p高表達組的中位總生存期未達到，其1年、3年、5年的估計總生存率分別是97.2%、79.8%、69.4%。而miR-148b-3p低表達組的中位總生存期是51.0個月（95%CI： 36.7-65.3），其1年、3年、5年的估計總生存率分別是92.3%、67.3%、43.1%。Kaplan-Meier生存曲線圖分析顯示miR-148b-3p高表達組患者的總生存時間顯著優(yōu)于低表達組患者（P=0.010），見圖1。

2.3 肺腺癌患者總生存的單因素和多因素分析 多因素Cox比例風險模型分析顯示腫瘤大小（P=0.032）、淋巴結轉移（P=0.005）和miR-148b-3p表達量（P=0.047）是影響肺腺癌患者總生存的獨立預測因子，見表2。

3 討論

在美國，癌癥的總體5年相對存活率超過60%，而肺癌的5年相對存活率只有18%左右[4]。當腫瘤局限于肺部且只在局部淋巴結擴散的時候，最有效的治療方法是手術。但是大多數(shù)肺癌患者在初次診斷時就已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉移或被為局部晚期，并不符合手術切除的條件，這是肺癌總體預后不良的一個重要原因[11]。因此，關于尋找新的肺癌治療靶標或預后生物標志物的研究，對于提高肺癌患者總體生存率和改善其預后，將具有十分重要的意義。

微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA分子，通過與互補靶mRNA結合導致mRNA翻譯抑制或降解，在細胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用[12]。在1993年，第一個微小RNA在秀麗隱桿線蟲上被發(fā)現(xiàn)[13]。7年后，第一個哺乳動物微小RNA，即let-7，也被發(fā)現(xiàn)[14]。這兩個關鍵事件導致了之后的一系列基因組研究，揭示了許多miRNA和其他非編碼RNA的廣泛轉錄[15]。近些年來，微小RNA已成為癌癥研究的一個熱點。許多研究報道微小RNA可以通過控制其靶mRNA的表達以促進或抑制腫瘤生長、侵襲、血管生成等，證明了微小RNA在癌癥生物學中發(fā)揮著重要的功能[16]。此外，據(jù)報道腫瘤的微小RNA表達譜可以用來定義相關的亞型，預測患者存活率和治療反應[6]。同時，由于微小RNA在臨床樣本中的有著比mRNA更高的穩(wěn)定性，因此比mRNA更加適合作為預后指標[17]。

表1 miR-148b-3p的表達量與肺腺癌患者臨床病理特征的相關性Tab 1 Correlation between expression level of miR-148b-3p and clinicopathological features of patients with lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者總生存的單因素和多因素Cox比例風險模型分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox proportional hazard models analysis of overall survival of patients with lung adenocarcinoma

圖1 miR-148b-3p表達量與肺腺癌患者總生存的Kaplan-Meier生存曲線分析圖Fig 1 Kaplan-Meier survival analysis between miR-148b-3p expression level and overall survival of patients with lung adenocarcinoma

MiR-148b-3p作為一種重要的miRNA，已經(jīng)被報道與多種癌癥密切相關。Zhang等[7]基于GEO分析，發(fā)現(xiàn)腎癌中miR-148b-3p的表達降低，并且通過功能實驗證明了miR-148b-3p可以通過調(diào)節(jié)FGF2-FGFR2信號通路，從而促進腎癌細胞凋亡并抑制細胞增殖、遷移和腫瘤生長。Li及其同事[9]發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p的表達與中的胃癌Dock6（一種非典型Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子）的表達呈負相關，并通過抑制Dock6/Rac1/Cdc42軸降低胃癌細胞的運動性，從而抑制胃癌轉移。同時，miR-148b-3p高表達組的胃癌患者的預后顯著優(yōu)于低表達組的患者。然而，目前miR-148b-3p在肺癌中的作用仍不清楚。

在本研究中，我們收集了2011年1月-2012年12月之間在我科進行手術切除的肺腺癌腫瘤標本123例。我們發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p在肺腺癌腫瘤組織中的表達量與腫瘤分化程度（P=0.001）、腫瘤大?。≒=0.007）顯著相關。我們通過單因素Cox比例風險模型分析發(fā)現(xiàn)，年齡（P=0.036）、腫瘤分化程度（P=0.042）、脈管癌栓（P=0.052）、腫瘤大?。≒=0.004）、淋巴結轉移（P=0.004）、遠處轉移（P=0.062）、術后治療（P=0.032）和miR-148b-3p表達水平（P=0.012）與患者的總生存相關。進一步將這些變量納入多因素Cox比例風險模型進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p表達量（P=0.047）、腫瘤大?。≒=0.032）、淋巴結轉移（P=0.005）是影響患者總生存的獨立預測因子。同時，Kaplan-Meier生存分析顯示miR-148b-3p高表達組患者的總生存顯著優(yōu)于miR-148b-3p低表達組患者（P=0.010），表明miR-148b-3p在肺腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。但是，miR-148b-3p在肺腺癌中具體的生物學作用和機制尚不清楚，亟需進一步闡明。如果miR-148b-3p的生物學作用能在體內(nèi)外實驗中得到進一步驗證，那么其將有助于肺腺癌的檢測與治療。本研究由于是回顧性分析，且樣本量較少（123例），無法充分控制混雜因素的影響，尚不足以指導臨床實踐，但卻為后續(xù)的臨床和基礎研究提供了有意義的參考。

綜上所述，miR-148b-3p表達量與肺腺癌的腫瘤分化程度、腫瘤大小顯著相關，是影響患者總生存的獨立預測因子。同時，miR-148b-3p高表達組患者的總生存顯著優(yōu)于miR-148b-3p低表達組患者。因此，miR-148b-3p可能在肺腺癌中扮演了非常重要的角色，有望成為新的肺腺癌治療靶標或預后生物標志物。