劉金力，洪秀杰，白 巖，畢少杰，楊宏志，王彥杰*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163411；2.大慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 大慶 163411；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

牛糞是常用的厭氧發(fā)酵原料，雖然其在厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)氣穩(wěn)定、對(duì)外界的環(huán)境緩沖能力強(qiáng)，但在單獨(dú)的牛糞厭氧發(fā)酵體系中，微量元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是有限的，難以為微生物生長(zhǎng)活動(dòng)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)[1]，并且牛糞單獨(dú)厭氧發(fā)酵周期長(zhǎng)，這也限制了它的實(shí)際應(yīng)用。餐廚垃圾的油脂、有機(jī)質(zhì)和易降解的碳水化合物含量高，營(yíng)養(yǎng)元素不均衡，其在厭氧發(fā)酵過(guò)程中易酸化。因此對(duì)牛糞和餐廚垃圾進(jìn)行混合發(fā)酵以使其能夠穩(wěn)定高效地產(chǎn)氣。

混合厭氧發(fā)酵技術(shù)是將兩種及以上的有機(jī)原料進(jìn)行同步消化，可以克服單一原料厭氧發(fā)酵的不足，增加甲烷產(chǎn)量，均衡體系中的營(yíng)養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)含水率[2]。一般認(rèn)為，適宜厭氧微生物生長(zhǎng)的C/N在20左右[3]，牛糞C/N高于此值，并且緩沖pH能力強(qiáng)，而餐廚垃圾的C/N較低。已有研究將餐廚垃圾與牛糞進(jìn)行混合厭氧發(fā)酵，發(fā)酵系統(tǒng)的緩沖能力得到增強(qiáng)，穩(wěn)定性得到提高，取得了良好的產(chǎn)氣效果[4-5]。厭氧發(fā)酵主要分為4個(gè)階段：水解階段、酸化階段、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段和產(chǎn)甲烷階段。在牛糞和餐廚垃圾混合厭氧發(fā)酵過(guò)程中水解酸化是厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的限速步驟[6-8]。酸化處理過(guò)程中溫度的改變，將影響系統(tǒng)中微生物的生長(zhǎng)和代謝，改變酸化產(chǎn)物組成和含量，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量的差異[9-10]；時(shí)間的長(zhǎng)短，影響著料液中VFAs的積累量和組成[11]。在單相厭氧消化系統(tǒng)中上述4個(gè)階段反應(yīng)同在一個(gè)反應(yīng)器進(jìn)行，而相對(duì)于傳統(tǒng)單相厭氧消化，兩相厭氧消化反應(yīng)系統(tǒng)能為產(chǎn)酸相中產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷相中產(chǎn)甲烷菌提供其各自所需要的最佳生長(zhǎng)條件。

響應(yīng)面法可以在特定區(qū)間內(nèi)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)和響應(yīng)值，已廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)條件和工藝條件的優(yōu)化[12-13]。本試驗(yàn)以餐廚垃圾和牛糞為混合原料，研究酸化處理?xiàng)l件對(duì)兩相厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酸化時(shí)間、酸化濃度和酸化溫度3個(gè)因素，利用中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酸化處理?xiàng)l件，以期提高餐廚垃圾和牛糞混合物的甲烷產(chǎn)量，為其工程應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)原料為牛糞和餐廚垃圾的混合物，牛糞和餐廚垃圾的比值為2∶1，其比值為揮發(fā)性固體干質(zhì)量比。供試餐廚垃圾取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)單位食堂，主要包括米飯、面食、蔬菜、肉類(lèi)等學(xué)校食堂就餐后的剩余物，取回后用JJ-2B粉碎機(jī)（金壇市盛威試驗(yàn)儀器廠(chǎng)）機(jī)械打漿2 min。牛糞取自黑龍江省肇東市宋站鎮(zhèn)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)新鮮牛糞。原料收集后均在-20℃條件下保存，使用前在4℃條件下解凍24 h。本實(shí)驗(yàn)室采用半連續(xù)發(fā)酵的方式通過(guò)添加餐廚垃圾馴化牛糞料液，將產(chǎn)氣與pH穩(wěn)定的料液經(jīng)自然沉降，所得的上清液作為接種物[14]。餐廚垃圾和牛糞的主要特性見(jiàn)表1。

表1 餐廚垃圾和牛糞的特性Table 1 The characteristics of food waste and dairy manure

1.2 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用的酸化裝置為1 L的螺口瓶，攪拌前安裝攪拌器進(jìn)行攪拌（圖1）。發(fā)酵裝置（圖2）為拆除攪拌裝置后的酸化裝置，用硅膠塞密封，料液的裝量為0.8 L。瓶塞上設(shè)有取樣口和集氣口，用1 L的鋁箔集氣袋收集產(chǎn)生的沼氣。

圖1 酸化裝置Figure 1 Acidification apparatus

圖2 發(fā)酵裝置Figure 2 Fermentation apparatus

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用批式厭氧消化方法，每個(gè)處理4次重復(fù)。將混合料液添加到酸化裝置中，經(jīng)酸化預(yù)處理后，添加接種物240 mL，稀釋料液的濃度至6%，后通入氮?dú)? min，使其形成厭氧環(huán)境。在35℃條件下厭氧發(fā)酵30 d。通過(guò)測(cè)定產(chǎn)氣量和甲烷含量，計(jì)算甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化條件。

在料液濃度為12%、攪拌轉(zhuǎn)速為100 r·min-1（2 min·次-1）條件下，分別設(shè)定攪拌頻率為0、1、2、3、4次·d-1，35℃條件下酸化處理12 h后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測(cè)定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化攪拌頻率。

在料液濃度為12%、攪拌頻率為4次·d-1（2 min·次-1）條件下，分別設(shè)定攪拌速率為 0、50、100、150、200 r·min-1，35 ℃條件下酸化處理12 h，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測(cè)定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化攪拌速率。

在料液濃度為12%、攪拌頻率為4次·d-1（2 min·次-1、100 r·min-1）條件下，分別設(shè)定酸化溫度為15、25、35、45、55 ℃，酸化處理12 h后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測(cè)定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化溫度。

設(shè)定料液濃度為8%、10%、12%、14%和16%，在攪拌頻率為4次·d-1（2 min·次-1、100 r·min-1），35℃條件下酸化處理12 h后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測(cè)定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化濃度。

在料液濃度為12%、攪拌轉(zhuǎn)速為4次·d-1（2 min·次-1、100 r·min-1）條件下，分別設(shè)定酸化時(shí)間為0、4、8、12、16、20、24 h，35 ℃條件下進(jìn)行酸化處理后，稀釋料液濃度至6%，厭氧發(fā)酵30 d，測(cè)定甲烷產(chǎn)率，確定最佳的酸化時(shí)間。

1.4 響應(yīng)面最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酸化溫度、酸化濃度、酸化時(shí)間3個(gè)因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Code and level for testing factors of response surface experiments

1.5 酸化處理對(duì)厭氧發(fā)酵的影響

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化出最佳酸化處理?xiàng)l件，將混合原料裝入圖1的酸化裝置中進(jìn)行最佳酸化條件預(yù)處理，然后在35℃條件下，置于圖2發(fā)酵裝置中厭氧發(fā)酵30 d，測(cè)定產(chǎn)氣率、甲烷總產(chǎn)量、甲烷含量和VS去除率。未酸化組直接置于圖2中的厭氧發(fā)酵瓶中進(jìn)行單相厭氧發(fā)酵。以未酸化處理直接厭氧發(fā)酵的處理作對(duì)照，進(jìn)行產(chǎn)氣率、甲烷總產(chǎn)量、甲烷含量和VS去除率數(shù)據(jù)的比較。

1.6 測(cè)定方法

TS和VS采用文獻(xiàn)[15]中的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。餐廚垃圾和牛糞的總氮和總碳采用multi N/C 3100總有機(jī)碳/總氮分析儀（Analytik Jena公司）測(cè)定（以干質(zhì)量計(jì)），通過(guò)計(jì)算總碳與總氮的值求得C/N。將集氣袋中的氣體采用排水法測(cè)定產(chǎn)氣量，采用GA2000便攜式沼氣分析儀（Geotech公司）測(cè)定甲烷含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert 7.1.3軟件的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析模塊對(duì)重要因素的水平進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)響應(yīng)面回歸過(guò)程（RSREG）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立酸化條件對(duì)甲烷總產(chǎn)量的二次回歸模型。采用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素方差分析（One way ANOVA，Turkey法）發(fā)現(xiàn)，攪拌頻率顯著影響了混合原料厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷率，但攪拌頻率超過(guò)2次·d-1的各處理之間無(wú)顯著差異（P＞0.05，圖3A）。攪拌頻率為3次·d-1時(shí)，產(chǎn)甲烷率達(dá)到最高值276.5 mL·g-1VS。圖3B顯示，攪拌速率對(duì)混合原料的產(chǎn)甲烷率有顯著影響，但攪拌速率超過(guò)50 r·min-1的處理之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），產(chǎn)甲烷率穩(wěn)定在263.5～275.6 mL·g-1VS。綜合減少能耗和獲得最高甲烷產(chǎn)量的考慮，最佳的攪拌條件為3次·d-（12 min·次-1，50 r·min-1）。

圖3C顯示，酸化溫度顯著影響了混合原料的產(chǎn)甲烷率，最佳的酸化溫度為35℃，產(chǎn)甲烷率達(dá)到最高值273.8 mL·g-1VS。

從圖3D可以發(fā)現(xiàn)，酸化濃度為10%和12%時(shí)的產(chǎn)甲烷率顯著高于其他濃度處理（P＜0.05），分別為274.4 mL·g-1VS和275.9 mL·g-1VS。較高的酸化濃度可以提高原料的處理效率，因此，最佳的酸化濃度為12%。

圖3 攪拌頻率（A）、攪拌速率（B）、酸化溫度（C）、酸化濃度（D）和酸化時(shí)間（E）對(duì)甲烷產(chǎn)率的影響Figure 3 Effect of（A）stirring frequency，（B）stirring rate，（C）acidification temperature,（D）acidification concentration and（E）acidification time on methane yield of mixed materials of food waste and manure

隨著酸化時(shí)間的延長(zhǎng)，pH先降低再升高，當(dāng)酸化時(shí)間超過(guò)一定范圍，揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）被嗜酸菌大量消耗，不利于后續(xù)產(chǎn)甲烷過(guò)程的進(jìn)行。圖3E顯示，酸化時(shí)間顯著影響了混合原料的產(chǎn)甲烷率，酸化時(shí)間為8 h時(shí)，獲得最高的產(chǎn)甲烷率271.3 mL·g-1VS。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酸化溫度（x1）、酸化濃度（x2）和酸化時(shí)間（x3）3個(gè)因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酸化條件下混合發(fā)酵甲烷產(chǎn)率的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Central composite design and results of experimental of methane production rate of anaerobic co-digestion of food waste and manure under acidification conditions

方差分析和酸化處理各因素的顯著性比較結(jié)果見(jiàn)表4。利用Design-Expert軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以甲烷產(chǎn)率為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸模型：

通過(guò)方差分析（表4）可知，模型的F=792.428 3＞F0.001，P＜0.001，R2=0.999 6，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.130 8＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明該模型能夠反映響應(yīng)值變化，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)產(chǎn)甲烷率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)及x2和x3交互項(xiàng)的影響均為極顯著。

表4 酸化處理后餐廚垃圾和牛糞混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷率的回歸方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of regression model of methane production of methane production rate of anaerobic co-digestion of food waste and manure under acidification conditions

圖4、圖5、圖6是酸化溫度、酸化濃度和酸化時(shí)間分別為35℃、12%和8 h的條件下，所得交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖?？梢钥闯觯峄瘻囟龋▁1）、酸化濃度（x2）和酸化時(shí)間（x3）3個(gè)因素與產(chǎn)甲烷率（Y）呈拋物線(xiàn)關(guān)系。3個(gè)響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸形曲面，且在所選范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極高值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

圖4 Y=f（35，x2，x3）響應(yīng)曲面圖Figure 4 Y=f（35，x2，x3）Response of factor interaction

圖5 Y=f（x1，12，x3）響應(yīng)曲面圖Figure 5 Y=f（x1，12，x3）Response of factor interaction

圖6 Y=f（x1，x2，8）響應(yīng)曲面圖Figure 6 Y=f（x1，x2，8）Response of factor interaction

圖4和圖6表明，隨著酸化濃度的增加，產(chǎn)甲烷率先升高，在酸化濃度為11%左右達(dá)到最高值，隨著酸化濃度的繼續(xù)提升，產(chǎn)甲烷率迅速下降至200 mL·g-1VS；圖4和圖5表明，隨著酸化時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)甲烷率也呈先升高再降低的趨勢(shì)，酸化處理8 h，厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷率最高；圖5和圖6表明，隨著酸化溫度的增加，產(chǎn)甲烷率先升高再降低，在酸化溫度為35℃左右時(shí)達(dá)到最高值。綜上所述，酸化溫度、酸化濃度和酸化時(shí)間對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷率均呈顯著性影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，預(yù)測(cè)出影響混合厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)率的最佳酸化處理?xiàng)l件為：酸化溫度35.80℃、酸化濃度10.42%和酸化時(shí)間7.62 h，預(yù)測(cè)值為287.60 mL·g-1VS。結(jié)合實(shí)際操作過(guò)程中的局限性，最終確定修正后的最佳酸化處理?xiàng)l件為：酸化溫度35.8℃、酸化濃度10.4%和酸化時(shí)間7.6 h，此時(shí)預(yù)測(cè)值為287.31 mL·g-1VS。

為了驗(yàn)證模型的可靠性和準(zhǔn)確性，在最佳酸化處理?xiàng)l件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，混合原料的產(chǎn)甲烷率為287.6 mL·g-1VS，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的相對(duì)偏差為1.14%，小于5%，響應(yīng)面分析法可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的甲烷產(chǎn)率。因此，利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行餐廚垃圾和牛糞混合厭氧發(fā)酵酸化處理?xiàng)l件優(yōu)化是可靠的。

2.4 酸化處理對(duì)厭氧發(fā)酵的影響

為驗(yàn)證酸化處理厭氧發(fā)酵的影響，將混合原料用自來(lái)水稀釋到指定濃度后直接進(jìn)行酸化，酸化過(guò)程中不添加接種物。酸化處理后，添加接種物240 mL，并用自來(lái)水調(diào)節(jié)發(fā)酵濃度至6%進(jìn)行厭氧發(fā)酵。通過(guò)比較經(jīng)最佳酸化條件處理的兩相厭氧發(fā)酵及未酸化直接發(fā)酵的發(fā)酵效果，發(fā)現(xiàn)兩相厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣率、甲烷產(chǎn)率、甲烷含量和VS去除率比單相厭氧均有提高，分別提高了9.4%、17.9%、7.1%和23.6%（表5）。

表5 兩相厭氧發(fā)酵與單相厭氧發(fā)酵主要參數(shù)比較Table 5 Comparison of main parameters of anaerobic co-digestion of food waste and manure between with acidification and CK

3 討論

混合原料兩相厭氧發(fā)酵研究需要建立最佳的酸化條件和產(chǎn)甲烷條件[16-17]，水解和酸化過(guò)程是兩相厭氧工藝中的限速步驟，水解條件的優(yōu)化對(duì)提高兩相厭氧發(fā)酵效率至關(guān)重要[18]，本研究對(duì)酸化條件進(jìn)行了優(yōu)化并得到了最佳的酸化條件，對(duì)產(chǎn)甲烷條件的優(yōu)化還需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

依據(jù)模型的系數(shù)估計(jì)值x1=792.4、x2=15.1和x3=1 109.7，得到影響因子的主效應(yīng)主次順序?yàn)樗峄瘯r(shí)間（x3）＞酸化溫度（x1）＞酸化濃度（x2）。

攪拌可使料液均勻分布，促進(jìn)熱傳遞，利于微生物和原料的接觸，促進(jìn)原料水解酸化，為產(chǎn)甲烷相提供充足的底物[19]。合適的攪拌能夠提升厭氧消化的潛力，在生產(chǎn)中攪拌頻率和攪拌速度的具體數(shù)值選擇上，還需考慮經(jīng)濟(jì)成本等多方面原因[20-22]，本試驗(yàn)得出的數(shù)值可作為一個(gè)參考指標(biāo)。此外，在酸化處理混合原料時(shí)，酸化裝置沒(méi)有密封，間斷性的攪拌提高了物料中的溶氧量，可能使體系中的兼性厭氧菌得到快速增長(zhǎng)，進(jìn)而加快了水解酸化的進(jìn)程，對(duì)其具體影響還需進(jìn)一步分析。目前主流的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是以VFAs為評(píng)價(jià)指標(biāo)，但在兩相厭氧發(fā)酵中的效果存在一定缺陷[23]。一般認(rèn)為酸化過(guò)程中產(chǎn)生的VFAs越多，產(chǎn)甲烷量越高[13]，但是不同的VFAs組成對(duì)產(chǎn)甲烷的貢獻(xiàn)不同，如丙酸的累積甚至?xí)种飘a(chǎn)甲烷過(guò)程的進(jìn)行[24]。因此，僅將VFAs作為考察有機(jī)物質(zhì)水解酸化效果的指標(biāo)存在一定的缺陷。本試驗(yàn)主要目的是為在實(shí)際生產(chǎn)中獲得更高的沼氣產(chǎn)氣量，因此，以產(chǎn)甲烷量為指標(biāo)，考察了不同酸化條件對(duì)混合原料厭氧發(fā)酵的影響，確定了最佳的酸化工藝。采用本研究?jī)?yōu)化的酸化處理?xiàng)l件，混合原料兩相發(fā)酵工藝的產(chǎn)氣率、產(chǎn)甲烷率、甲烷含量和VS去除率均高于未經(jīng)酸化處理的單相厭氧發(fā)酵工藝，這與劉爽[25]的研究結(jié)果基本一致。

將厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸相和產(chǎn)甲烷相分離，是優(yōu)化了兩者的各自功能，還是阻礙了兩者的協(xié)同關(guān)系，尚不明確。但目前越來(lái)越多的研究表明，與傳統(tǒng)的單相厭氧發(fā)酵技術(shù)相比，兩相厭氧發(fā)酵工藝在處理高濃度有機(jī)廢棄物時(shí)更具優(yōu)勢(shì)[26-27]。水解酸化過(guò)程是厭氧工藝中的限速步驟，優(yōu)化水解酸化條件對(duì)提高兩相厭氧發(fā)酵效率具有重要意義[28]。

4 結(jié)論

（1）酸化時(shí)間、酸化溫度和酸化濃度3個(gè)因素均能顯著影響甲烷產(chǎn)率，其對(duì)甲烷產(chǎn)率影響的大小為酸化時(shí)間＞酸化溫度＞酸化濃度。最佳的產(chǎn)氣條件為：濃度10.4%、溫度35.8℃、處理時(shí)間7.6 h。

（2）最佳酸化條件處理的兩相厭氧發(fā)酵與未處理單相厭氧發(fā)酵相比其產(chǎn)氣率、甲烷產(chǎn)率、甲烷含量和VS去除率分別提高了9.4%、17.9%、7.1%和23.6%。

（3）通過(guò)差異顯著性和產(chǎn)氣量分析得到最適攪拌頻率和攪拌速率分別為3次·d-1（2 min·次-1）和50 r·min-1。