王 君， 陳奕瑋， 趙 坤， 趙光耀， 蔣文雯

（貴州大學， 貴州 貴陽550000）

高血壓作為一種最常見的慢性疾病, 常伴有頭暈、 頭痛、 頸項板緊、 疲勞、 心悸等癥狀, 隨著人口老齡化加劇,其發(fā)病率每年都呈持續(xù)增長的狀態(tài), 給患者、 家庭、 社會造成了嚴重的負擔。 左金丸出自朱丹溪名方, 由黃連、 吳茱萸以6 ∶1 比例配伍而成, 方中吳茱萸性溫, 入肝、 腎、脾、 胃經(jīng), 上可溫胃散寒, 下可溫暖肝腎, 又能降逆止嘔；黃連性寒, 歸心、 脾、 胃、 肝、 膽、 大腸經(jīng), 清熱燥濕,邪火解毒, 具有抗腫瘤、 降壓降脂等活性。 臨床研究證實,左金丸降壓作用比尼莫地平緩慢、 持久、 平穩(wěn), 療效確切[1], 但其分子作用機制尚未闡明。

中藥復方具有多成分-多靶點-多途徑的特點, 現(xiàn)有研究手段難以有效說明其作用機制。 網(wǎng)絡藥理學是隨基因組學、 蛋白組學、 系統(tǒng)生物學發(fā)展應運而生的, 通過網(wǎng)絡拓撲分析來觀察藥物對病理網(wǎng)絡的干預與影響, 揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘, 這與中醫(yī)學從整體角度去診治疾病的理論, 以及中藥及其復方多成分、 多途徑、 多靶點協(xié)同作用的原理殊途同歸, 無疑為跨越中西醫(yī)間的鴻溝架起了橋梁[2], 也為中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化指明了方向。本研究通過網(wǎng)絡藥理學研究左金丸潛在活性成分、 關鍵靶點、 主要通路, 為揭示該制劑治療高血壓的科學內(nèi)涵提供了參考。

1 方法

1.1 活性成分虛擬篩選與ADME 分析 通過查閱大量文獻, 收集左金丸已報道的所有活性成分, 同時依托中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP 收集中吳茱萸、 黃連主要活性成分。 該數(shù)據(jù)庫給每個化合物提供了詳細的吸收、分布、 代謝、 排泄（ADME） 參數(shù), 可通過限制口服吸收利用度（OB）、 藥物相似性 （DL）、 Caco-2 細胞滲透性（Caco-2）、 血腦屏障（BBB）、 半衰期（HL） 等參數(shù), 虛擬篩選活性成分。

1.2 活性成分靶點預測 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫、 STITCH 數(shù)據(jù)庫（http： / /stitch. embl. de/）、 SwissTarget 數(shù)據(jù)庫（http： / /www. swisstargetprediction. ch/） 預測活性成分的作用靶點, 并剔除重復靶點。 靶點相應基因通過檢索Uniprot中的Uniprot KB 數(shù) 據(jù) 庫Uniprot （http： / /www. uniprot.org/）, 檢索方式為“organism： ‘homo sapiens’ AND reviewed： yes”, 將檢索結果以Excel 格式導出, 即得Uniprot數(shù)據(jù)庫中人類相關靶蛋白及其對應基因[3]。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡構建 將活性成分及其對應的靶點輸 入 Cytoscape 3.6.0 軟 件 （http： / /www. cytoscape.org/）, 構建兩者網(wǎng)絡。

1.4 高血壓靶點篩選 在OMIM 數(shù)據(jù)庫（http： / /omim.org/）、 PharmGkb （https： / /www. pharmgkb. org/）、 TTD（http： / /bidd. Nus. edu. sg/group/cjttd/）、 DrugBank （http： / /www. drugbank. ca/）、 GAD 數(shù)據(jù)庫（http： / /geneticassociationdb. nih. gov/） 中輸入關鍵詞Hypertension, 搜索與高血壓相關疾病靶點, 并去除重復基因[4], 即得。

1.5 藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡構建 根據(jù)“1.3” “1.4” 項下結果, 應用Cytoscape 3.6.0 中的關聯(lián)（Merge） 功能, 將2 個結果合并成藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡圖, 成分靶點圖和疾病靶點圖交集部分即治療高血壓的關鍵靶點, 再通過NetworkAnalyzer 工具計算網(wǎng)絡拓撲參數(shù)。 Degree 是指一個節(jié)點與其他節(jié)點相連的數(shù)目,本研究分析Degree≥5 的活性成分。

1.6 靶點類型歸屬 DisGeNET （http： / /www. disgenet.org/web/DisGeNET/menu） 是1 個包含與人類疾病相關的基因和變異的數(shù)據(jù)庫。 選擇靶點檢索后, 依次輸入關鍵靶點,得到靶點類型相關信息[5]。

1.7 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與分析 String 數(shù)據(jù)庫（https： / /string-db. org/） 是一種包含已知和預測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫, 收集了大量蛋白相互作用關系, 共涉及9 643 763 個蛋白, 1 380 838 440 個相互作用, 包括實驗檢測、 生物信息學方法預測得到的數(shù)據(jù)。 將上述關鍵靶點導入String 數(shù)據(jù)庫, 限定物種為人, 最低相互作用閥值設為中等置信度0.4 “medium confidence”, 其余參數(shù)保持默認設置, 獲取蛋白相互作用關系。 圖中節(jié)點之間連線越粗, 表明關聯(lián)度越大。

1.8 GO 生物過程、 KEGG 通路富集分析 在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https： / /david. ncifcrf. gov/） 基因列表中輸入關鍵靶點的基因名, 在基因標識符欄中選擇“official-genesymbol”, DAVID 平臺列表與背景均設置為“Homo sapiens”（人類）, 分析工具選擇“functional annotation tool”。 根據(jù)P＜0.01、 靶點數(shù)量（Count） ≥3 篩選出GO 生物過程和KEGG 通路。

2 結果

2.1 活性成分及ADME 參數(shù) 共搜集到224 種成分, 其中吳茱萸176 種, 黃連48 種, 再對其ADME 參數(shù)進行篩選,條件為OB≥30%, DL≥0.18, Caco-2≥-0.4, 發(fā)現(xiàn)25 種（其中小檗堿是吳茱萸、 黃連共有的成分） 符合條件, 作為候選化合物。 但查閱文獻發(fā)現(xiàn), 目前研究的黃連-吳茱萸藥對主要功效物質(zhì)基礎也包括檸檬苦素、 藥根堿、 非洲防己堿[6], 故也將三者納入候選化合物。 見表1。

2.2 活性成分靶點 共得到80 個活性成分靶點, 并將其輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫, 轉換成對應的基因名稱。

2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡 共有108 個節(jié)點, 406 條邊, 見圖1。

2.4 高血壓靶點 分別在OMIM 數(shù)據(jù)庫、 PharmGkb、TTD、 DrugBank、 GAD 中發(fā)現(xiàn)35、 120、 59、 1、 12 個高血壓潛在作用靶點, 剔除重復靶點后得到210 個。

2.5 藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡 共有47 個節(jié)點,154 條邊, 見圖2。 Degree≥6 的活性成分有（R） -四氫小檗堿（Degree = 11）、 1-甲 基-2-壬 基-4-喹 諾 酮 （Degree =11）、 吳茱萸酰胺甲（Degree=10）、 β-谷甾醇（Degree=9）、 氧化小檗堿（Degree=7）、 小檗堿（Degree=6）、 吳茱萸堿（Degree=6） 等, 度值越大, 表明左金丸通過該成分治療高血壓的可能性越大, 見表2。

表1 左金丸中活性成分及ADME 參數(shù)

圖1 左金丸活性成分-靶點網(wǎng)絡

2.6 關鍵靶點類型 將圖2 中18 個關鍵靶點輸入DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中, 得到靶點類型相關信息, 見表3, 可知受體最多（10 個）, 其次是氧化還原酶（3 個）、 轉移酶（1個）、 轉錄因子（1 個）、 水解酶（1 個）、 分子伴侶（1 個）。

2.7 蛋白相互作用網(wǎng)絡 String 數(shù)據(jù)庫構建的蛋白相互作用網(wǎng)絡中包含16 個靶蛋白節(jié)點（PDE3A、 NR3C2 未參與蛋白互作）, 共有20 條相互作用連線, 其中度值較大的有Degree=5 的α-1B 腎上腺素能受體（ADRA1B）、 Degree=4的毒蕈堿乙酰膽堿受體M5 （CHRM5）、 Degree=4 的5-羥色胺2 A 受體（HTR2A）、 Degree=4 的α-1D 腎上腺素能受體（ADRA1D）、 Degree = 4 的α-1 A 腎 上 腺 素 能 受 體（ADRA1A） 靶蛋白, 均與其他蛋白相互作用較強。 見圖3。

圖2 左金丸藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡

表2 左金丸藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡拓撲分析

表3 左金丸關鍵靶點類型

2.8 GO 生物過程、 KEGG 通路富集分析 將圖2 中18 個關鍵靶標輸入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫, 根據(jù)P＜0.01 且靶點數(shù)量≥3 篩選出16 個GO 生物過程、 7 條KEGG 通路。 左金丸治療高血壓的作用機制可能與腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、 血管收縮的正調(diào)節(jié)、 細胞-細胞信號傳導、 平滑肌收縮的正調(diào)節(jié)、 去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動脈血壓的調(diào)節(jié)等生物過程相關, 見表4。 另外, 關鍵靶標顯著富集于環(huán)鳥苷酸-蛋白激酶G 信號通路（cGMP-PKG 信號通路）、 鈣信號通路、 神經(jīng)活性配體-受體相互作用、 唾液分泌、 心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解、 血管內(nèi)皮生長因子信號通路（VEGF 信號通路） 等, 見表5。

表4 左金丸GO 生物過程分析

表5 左金丸KEGG 通路富集分析

圖3 左金丸蛋白相互作用網(wǎng)絡

3 討論

左金丸以黃連為主, 佐以吳茱萸, 兩者比例為6 ∶1,其藥理研究方向主要集中在抗癌、 抗?jié)儭?對胃腸功能的影響、 不同配伍比例對藥效的影響等, 近年來研究顯示它還有降血壓的功能, 但具體機制不清楚。 本研究通過網(wǎng)絡藥理學研究左金丸治療高血壓的分子機制, 從藥材-疾病-關鍵靶點-疾病網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn), （R） -四氫小檗堿、 1-甲基-2-壬基-4-喹諾酮、 吳茱萸酰胺甲、 β-谷甾醇、 氧化小檗堿、小檗堿、 吳茱萸堿的Degree 遠高于其他成分, 表明它們可能是降壓的主要藥效基礎, 其中（R） -四氫小檗堿屬于四氫異喹啉類生物堿, 具有抗高血壓、 抗心律失常、 抗纖維性顫動、 抗急性心肌梗死、 防治缺血再灌注損傷作用[7]；1-甲基-2-壬基-4-喹諾酮屬于喹諾酮類生物堿, 是影響血壓的重要成分, 在1 ～100 μmol/L 范圍內(nèi)均可不同程度地抑制去甲腎上腺素和高鉀引起的血管收縮, 并可通過血管α1受體、 鈣離子通道2 個途徑達到血管擴張、 舒張平滑肌的作用[8-9]； 吳茱萸酰胺甲屬于吲哚類生物堿, 目前對其藥理活性的研究較少, 可能與其他成分協(xié)同作用來降低高血壓；肖志彬等[10]報道, β-谷甾醇具有抗炎、 抑制腫瘤、 免疫調(diào)節(jié)、 抗高血脂、 鎮(zhèn)痛、 促進傷口愈合等廣泛藥理活性, 炎癥介導血管損傷是血壓升高的病理基礎, 而該成分可能正是通過減少炎癥反應來發(fā)揮降壓作用； 吳茱萸堿作為吳茱萸主要有效成分, 口服生物利用度最高（86.02%）, 能較好地被胃腸道吸收, 還具有鎮(zhèn)痛消炎、 調(diào)節(jié)體溫、 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、 減肥等作用[11]； 小檗堿為黃連主要有效成分, 屬異喹啉類生物堿, 其心血管藥理作用包括降低血壓、 抗心律失常、 調(diào)節(jié)脂代謝、 抗動脈粥樣硬化、 改善頑固性心衰等[12], 以上報道與本研究結果相互印證, 表明網(wǎng)絡藥理學的研究左金丸治療高血壓的分子機制具有科學性。

靶蛋白 ADRA1A、 ADRA1B、 ADRA1D、 CHRM5、HTR2A 在蛋白相互作用網(wǎng)絡中的Degree 值較高, 表明左金丸可能通過以上靶點達到降壓療效。 叢科等[13-14]報道,ADRA1A、 ADRA1B、 ADRA1D 是α1 型腎上腺素能受體的3 種亞型, 在交感神經(jīng)傳遞, 肝臟代謝的調(diào)節(jié), 血管張力的控制, 心臟收縮過程中發(fā)揮了重要作用； CHRM5 為膽堿能受體, 被激活后會導致多巴胺釋放[15]； 程茹等[16-17]發(fā)現(xiàn), 血管內(nèi)皮受損后血小板活化, 并釋放5-羥色胺等血管活性物質(zhì), 其中5-羥色胺作用于血小板表面的5-羥色胺2 A 受體, 促進血小板聚集活化及血栓形成, 由于高血壓患者易形成血栓, 故左金丸調(diào)控HTR2A 時可間接影響高血壓病程。

靶點類型歸屬和GO 生物過程分析顯示, 左金丸治療高血壓涉及受體、 氧化還原酶、 轉移酶、 轉錄因子、 水解酶、 分子伴侶等多種物質(zhì), 與腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、 細胞-細胞信號傳導、 平滑肌收縮、 去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮等生物過程相關。 KEGG 通路富集結果表明, 左金丸關鍵靶點基因富集在與高血壓密切相關的信號通路上, 如cGMP-PKG 信號通路、 鈣信號通路、 神經(jīng)活性配體-受體相互作用、 唾液分泌、 心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、 調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解、VEGF 信號通路等通路。 王曉華等[18]報道, 大多數(shù)組織中cGMP-PKG 信號通路可調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞收縮和舒張,抗高血壓。 抗心肌肥大, 抗動脈粥樣硬化, 抗血管損傷/再狹窄。 另外, 鈣離子信號通路控制新陳代謝、 分泌、 平滑肌收縮、 增殖等多種過程[19], 左金丸可能通過調(diào)節(jié)平滑肌收縮來發(fā)揮藥效, 與GO 生物過程中平滑肌的收縮相佐證。

神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路是質(zhì)膜上所有與細胞內(nèi)外信號通路相關的受體和配體的集合, 調(diào)節(jié)生理節(jié)律、內(nèi)分泌、 情緒、 學習、 記憶等, 而內(nèi)分泌失調(diào)是引起高血壓的常見原因[20]。 左金丸可通過唾液分泌來間接調(diào)控高血壓, 它是維持口腔正常生理功能所必需的, 腺泡上皮細胞內(nèi)的Ca2+濃度對其造成影響[21], 同時Ca2+也參與鈣信號通路, 再次表明各通路復雜交互, 協(xié)同發(fā)揮作用。 趙璐等[22]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn), 不良生活方式導致的肥胖是高血壓發(fā)病的重要因素, 而脂肪分解有利于達到降壓效果； 陳明等[23]報道, VEGF 信號通路與高血壓發(fā)生有著直接關系, 當高血壓患者內(nèi)皮功能受損后血壓明顯增高, 上述結果與本研究基本一致, 表明不同信號通路之間存在一定聯(lián)系, 共同調(diào)節(jié)人體機能, 體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點-多途徑的作用特點。

綜上所述, 本研究從網(wǎng)絡藥理學角度揭示了左金丸治療高血壓的可能分子機制, 為該制劑進一步藥效物質(zhì)基礎分析和機制考察提供了依據(jù), 同時也使后續(xù)研究更有針對性。