李玉輝 趙喜慶 陸麗娟 劉艷坤 劉巖 胡萬寧 李玉鳳
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是惡性度最高的膠質(zhì)瘤。由于GBM細(xì)胞增殖快且多呈侵襲性生長,手術(shù)很難將腫瘤組織全部切除,這是GBM容易復(fù)發(fā)的主要原因。進(jìn)一步闡明GBM細(xì)胞增殖和侵襲性生長的分子機(jī)制可為臨床治療提供新思路。有研究發(fā)現(xiàn)β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(beta-transducin repeat-containing proteins,β-TrCP1)在正常腦組織中呈高表達(dá),而在膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá),在惡性度較高的GBM中的表達(dá)水平低于惡性度較低的膠質(zhì)瘤[1]。提示β-TrCP1在膠質(zhì)瘤中可能起抑癌作用,但其對(duì)GBM細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及機(jī)制尚不明。皰疹病毒相關(guān)性泛素特異性蛋白酶 (herpes associated ubiquitin specific proteas,HAUSP)在正常腦組織中不表達(dá),隨著膠質(zhì)瘤惡性度的升高,其表達(dá)增加[2]。但UAHSP對(duì)GBM增殖和遷移能力的影響及機(jī)制尚不明。本研究通過在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞系中分別過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP,分析了對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響,并分析了二者表達(dá)改變對(duì)表觀遺傳調(diào)控因子UHRF1(ubiquitin-like containing PHD ring finger)表達(dá)的影響,以期為GBM的發(fā)病機(jī)制提供表觀遺傳學(xué)依據(jù),為GBM的臨床治療探索新的方向。
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。TRIzol總RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司,SYBR Premix Ex Taq染料法熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Invitrogen公司,ECL顯影液購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。β-TrCP1小鼠抗人單克隆抗體購自美國RD公司(MAB7675),UHRF1兔抗人多克隆抗體購自SAB公司 (32666),HAUSP兔抗人多克隆抗體(ab4080)和GAPDH小鼠抗人單克隆抗體(ab9484)購自美國Abcam公司。
U87細(xì)胞培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,呈貼壁生長,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
委托北京吉瑪公司構(gòu)建N1-β-TrCP1過表達(dá)質(zhì)粒,將對(duì)數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合達(dá)到70%~80%時(shí)以Lipofectamine 2000為載體按照說明書分別將N1空質(zhì)粒及N1-β-TrCP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞。委托北京吉瑪公司體外化學(xué)合成靶向 HAUSP mRNA的小干擾 RNA(siRNA),siRNA的轉(zhuǎn)染步驟同β-TrCP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞分為N1空質(zhì)粒對(duì)照組(NC)及 N1-β-TrCP1質(zhì)粒組(β-TrCP1);將轉(zhuǎn)染siRNA的U87細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA的對(duì)照組(si-NC)、轉(zhuǎn)染靶向HAUSPmRNA 的 siRNA-1 組(si-HAUSP-1)、si-HAUSP-2 組及si-HAUSP-3組。
NC組、β-TrCP1組、si-NC 組和 si-HAUSP-1組、si-HAUSP-2組及si-HAUSP-3組U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染24 h后,采用TRIzol裂解液分別提取各組細(xì)胞總RNA,Thermo超微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和質(zhì)量。取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)在Thermo RT-qPCR儀上進(jìn)行。引物由北京吉瑪公司合成。 β-TrCP1、HAUSP、UHRF1、β-actin的引物序列見表1。β-actin為內(nèi)參,每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,各個(gè)基因的反應(yīng)程序均為:94℃ 3 min,94℃30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)。 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,以2-△△Ct計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。因si-HAUSP-2組中HAUSP mRNA下降最為顯著,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用si-HAUSP-2(si-HAUSP組)。
表1 β-TrCP1、HAUSP、UHRF1、β-actin 的引物序列
NC組、β-TrCP1組、si-NC組和 si-HAUSP組U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染48 h后,分別消化并收集各組細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液清洗后,加入裂解液(150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,0.5%NP-40,含混合蛋白酶抑制劑)置于冰上,水平搖床裂解20 min。之后于4℃、12 000 r/min離心10 min(離心半徑5.5 cm),吸取蛋白上清置新的EP管中,用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品于100℃變性10 min,分別和各自對(duì)照組(NC組和 β-TrCP1組)、(si-NC 組和 si-HAUSP組)經(jīng)10%SDS-PAGE電泳將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。NC組和β-TrCP1組蛋白印跡膜分別加入β-TrCP1抗體 (1∶500稀釋)、UHRF1 抗體(1∶500 稀釋)及 GAPDH 抗體(1∶1000稀釋);si-NC組和si-HAUSP組蛋白印跡膜分別加入 HAUSP 抗體(1∶500 稀釋)、UHRF1 抗體(1∶500 稀釋)及 GAPDH 抗體 (1∶1000 稀釋),4℃過夜孵育。 TBST緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1%Tween 20,pH 7.4)洗膜 3 次,通用型二抗 37℃濕盒中孵育 45 min,TBST洗膜 3次,ECL顯影,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像進(jìn)行灰度值分析,以GAPDH為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。
U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后消化計(jì)數(shù),種入96孔板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),至第1、2、3、4和5天,每孔中加入CCK8溶液(10 μL/100 μL 培養(yǎng)基),繼續(xù)入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定OD值。
U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后消化計(jì)數(shù),將細(xì)胞離心棄上清,用opti-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按每個(gè)transwell小室加入3×104個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞懸液加入到鋪有基質(zhì)膠(matrigel)的transwell小室的上室,在下室中加入600 μL 20%DMEM培養(yǎng)基。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后分別用1∶3的冰乙酸,甲醇溶液固定,結(jié)晶紫染色,清水清洗并拍照。每孔隨機(jī)選擇上下左右及中間5個(gè)高倍視野。用Image J計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù),以反應(yīng)細(xì)胞的侵襲能力。
采用 SPSS17.0軟件分析,RT-qPCR、Western blot及CCK-8和基質(zhì)膠-transwell的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示,β-TrCP1組細(xì)胞中β-TrCP1的mRNA水平顯著高于空質(zhì)粒NC組 (P<0.01,圖 1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示 β-TrCP1組細(xì)胞中β-TrCP1的蛋白水平顯著高于NC組 (P<0.01,圖 1B)。
CCK8法檢測結(jié)果顯示,β-TrCP1組U87細(xì)胞在第4、5天的增殖能力顯著低于同時(shí)期的NC組細(xì)胞(均P<0.05,圖 1C)。 基質(zhì)膠-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染第4天,β-TrCP1組U87細(xì)胞穿過鋪有基質(zhì)膠的基底膜的細(xì)胞數(shù)低于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖 1D)。
RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示,si-HAUSP-1組和si-HAUSP-2組U87細(xì)胞中HAUSPmRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于無意義序列對(duì)照(si-NC)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),si-HAUSP-3 組 U87 細(xì)胞中HAUSPmRNA相對(duì)表達(dá)水平與si-NC組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖 2A)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用作用效果最明顯的 si-HAUSP-2(si-HAUSP組)。Western blot結(jié)果顯示,si-HAUSP組細(xì)胞中HAUSP蛋白水平顯著低于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖 2B)。
圖1 過表達(dá)β-TrCP1對(duì)U87細(xì)胞增殖和侵襲能力影響
圖2 敲低HAUSP對(duì)U87細(xì)胞增殖和侵襲能力影響
CCK8法檢測結(jié)果顯示,si-HAUSP組細(xì)胞在第4天和第5天的增殖能力顯著低于同時(shí)期si-NC組細(xì)胞(均P<0.05,圖 2C)。 基質(zhì)膠-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染第4天,si-HAUSP組細(xì)胞穿過鋪有基質(zhì)膠的基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖 2D)。
RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示,β-TrCP1組和NC組UHRF1mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3A)。轉(zhuǎn)染48 h后Western blot結(jié)果顯示,β-TrCP1組細(xì)胞中UHRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05,圖 3B)。 此外,RT-qPCR 法檢測結(jié)果顯示,si-HAUSP組和siNC組細(xì)胞中UHRF1mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3C)。Western blot結(jié)果顯示,si-HAUSP組細(xì)胞中UHRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于siNC組(P<0.05,圖3D)。
泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的特異性蛋白質(zhì)降解途徑。靶蛋白通過泛素激活酶E1、泛素偶聯(lián)酶E2和泛素連接酶E3的一系列作用與多個(gè)泛素共價(jià)結(jié)合后,被蛋白酶復(fù)合體識(shí)別并降解。泛素化/去泛素化的異??蓪?dǎo)致細(xì)胞中高表達(dá)的癌基因蛋白不能及時(shí)從細(xì)胞中被降解清除,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
β-TrCP1作為一種E3泛素連接酶,可以識(shí)別并泛素化降解磷 酸化的 IκB、NF-κB、β-catenin、E-mil和Snail等蛋白發(fā)揮多種生物學(xué)功能[3,4]。本研究發(fā)現(xiàn)在U87細(xì)胞系中過表達(dá)β-TrCP1可以抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力,說明β-TrCP1在GBM中發(fā)揮抑癌作用。與Liang等[1]的報(bào)道一致,即β-TrCP1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平越低,患者預(yù)后越差,在GBM中的表達(dá)最低。但在結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)β-TRCP1起促癌作用,與膠質(zhì)瘤中的作用相反[5-10]。這些結(jié)果說明β-TrCP1的表達(dá)和作用呈組織異質(zhì)性。
另一方面,HAUSP是泛素特異性修飾酶家族(ubiquitin specific processing enzymes,USP)成員之一,又稱USP7。HAUSP能催化水解泛素C-末端與靶蛋白間的肽鏈連接,使靶蛋白去泛素化,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、DNA修復(fù)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低去泛素化酶HAUSP也抑制GBM細(xì)胞的增殖和侵襲能力,說明HAUSP在GBM中起促癌作用。這可以從細(xì)胞學(xué)水平支持以往臨床組織中的報(bào)道,即HAUSP在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于正常腦組織,且在Ⅰ~Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)逐漸增高[12,13]。GBM細(xì)胞中高表達(dá)的HAUSP蛋白穩(wěn)定E3泛素連接酶MDM2,后者泛素化腫瘤抑制因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白(retinoblastoma-associated protein,Rb)導(dǎo)致Rb蛋白降解,是導(dǎo)致GBM細(xì)胞高度惡性的原因之一[13]。結(jié)合本研究結(jié)果,可以推測GBM細(xì)胞中高表達(dá)的HAUSP可以直接或間接靶向多種腫瘤抑制因子發(fā)揮促癌作用。有研究表明HAUSP在前列腺癌、肝癌及乳腺癌組織中呈高表達(dá),且其表達(dá)水平與惡性進(jìn)展呈正相關(guān)[14-17]。這些結(jié)果說明HAUSP在這些組織腫瘤中均起促癌作用。
圖3 過表達(dá)β-TrCP1或敲低HAUSP對(duì)U87細(xì)胞中UHRF1表達(dá)的影響
近年來的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控因子UHRF1在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)且與腫瘤的分級(jí)和預(yù)后相關(guān),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18,19]。蛋白水平的研究發(fā)現(xiàn),β-TrCP1可與UHRF1的第1-282氨基酸位點(diǎn)結(jié)合,并使UHRF1的663賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生泛素化而降解[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP不影響UHRF1的mRNA水平,但可降低其蛋白水平。因此推測GBM細(xì)胞中UHRF1蛋白水平受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑調(diào)控,GBM中低表達(dá)的β-TrCP1及高表達(dá)的HAUSP導(dǎo)致UHRF1的蛋白水平升高,影響UHRF1下游參與調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)因子的表達(dá),從而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和遷移能力。
綜上所述,泛素化酶β-TrCP1負(fù)向調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力,泛素化酶HAUSP正向調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力,UHRF1蛋白穩(wěn)定性改變可能是原因之一。GBM中低表達(dá)的β-TrCP1以及高表達(dá)的HAUSP可導(dǎo)致UHRF1蛋白水平增高,繼而引起腫瘤抑制因子表觀遺傳修飾的改變而使之沉默,這是導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲能力增強(qiáng)的重要因素。過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP為抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和侵襲提供了新思路。
中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志2019年4期