王 萍，王功霞，曹 沖*

（1.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271016；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250101）

被動皮膚過敏試驗(yàn)是《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]規(guī)定的檢測注射劑藥物過敏性的試驗(yàn)方法之一，通常選用大鼠為試驗(yàn)動物，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)，致敏給藥方法可選擇靜脈、腹腔或皮下注射液等，共給藥3～5次，末次致敏后第10～14天制備致敏血清。

研究發(fā)現(xiàn)[2-5]，以卵白蛋白為致敏原進(jìn)行大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)時(shí)，加入佐劑條件下動物對抗原更為敏感，免疫效果較好，常用的佐劑為氫氧化鋁凝膠佐劑，但配制方法較繁瑣，對pH值要求較高。大鼠抗體產(chǎn)生階段，致敏給藥方法多選用皮下注射，由于佐劑的吸收速度慢，導(dǎo)致皮下注射后易形成腫塊，且有些受試物臨床給藥途徑明確指出禁止皮下給藥。針對以上問題，本試驗(yàn)以卵白蛋白為致敏原，佐劑選擇Sigma公司生產(chǎn)的油佐劑──弗氏完全佐劑，致敏給藥方法選擇腹腔注射，研究不同給藥劑量，不同致敏次數(shù)，末次致敏后不同制備血清時(shí)間等因素條件對大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)免疫應(yīng)答結(jié)果的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACS-JJ-Tiger電子計(jì)價(jià)秤（梅特勒-托利多）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試劑

卵白蛋白（批號：326A052，Sigma公司）；0.9 %氯化鈉注射液（批號：1C16101307，山東齊都藥業(yè)）；弗氏完全佐劑（批號SLBM2183V，Sigma公司）。

1.3 動物

SD大鼠，SPF級，體重100～200 g，雌雄各48只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施。試驗(yàn)在屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK（魯）20140008，動物房溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %。

2 方法

2.1 分組、致敏與致敏血清制備

96只大鼠隨機(jī)分為16組，每組6只，2只用于抗血清制備，4只用于被動激發(fā)。將卵白蛋白溶液與弗氏完全佐劑按1:1比例混勻，1，2，5，6，9，10組大鼠于第1，3，5天分別腹腔注射給予致敏物與佐劑混合物1 ml，各組均致敏3次；3，4，7，8，11，12組大鼠于第1，3，5，7，9天分別腹腔注射給予相同混合物1 ml，各組均致敏5次。陰性對照組大鼠給予0.9 %氯化鈉注射液與弗氏完全佐劑的混合物，13、14組致敏3次，15，16組致敏5次。末次致敏后第10天或第14天，大鼠以1 %戊巴比妥鈉麻醉（50 mg/kg，腹腔注射）后腹主動脈采血，血液樣本在室溫下1500 r/min離心10 min。取上清，將每組動物的抗血清混合。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2 被動致敏及激發(fā)

各組制備好的抗血清用0.9 %氯化鈉注射液稀釋成不同濃度，分別為原液、1:2，1:4，1:8。采用10 mg/ml丙泊酚，按10 mg/kg尾靜脈注射麻醉大鼠，在距離脊柱約1.5 cm處背部脫毛，脫毛區(qū)域約5 cm×6 cm。在脫毛區(qū)域旁，按一定方向皮內(nèi)注射各對應(yīng)組的不同稀釋度抗血清0.1 ml。24 h后分別靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量0.5 %伊文思藍(lán)染料共1 ml[6]。

2.3 藍(lán)斑測定

激發(fā)后約30 min用3 %戊巴比妥鈉麻醉（90 mg/kg，腹腔注射）處死動物，測量背部皮膚藍(lán)斑直徑，以長徑與短徑的平均值作為藍(lán)斑直徑。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第10天制備致敏血清）

13組：采用0.9 %氯化鈉注射液3次致敏，末次致敏后第10天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

1，5，9組：卵白蛋白劑量為5 mg/只時(shí)，4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，藍(lán)斑直徑均大于5 mm，陽性反應(yīng)率為100 %；4只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，3只動物藍(lán)斑直徑大于5 mm，陽性反應(yīng)率為75 %；2只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，1只動物藍(lán)斑直徑大于5 mm，陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為10，20 mg/只時(shí)，各組均有4只動物在原液、1:2、1:4、1:8注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑，且藍(lán)斑直徑均大于5 mm，陽性反應(yīng)率為100 %。見表2。

表2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

表2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應(yīng)動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 1 5 4/4 14.19±3.08 4/4 8.68±1.99 3/4 6.90±2.78 1/4 2.86±3.29 5 10 4/4 17.18±1.97 4/4 10.00±1.77 4/4 8.35±2.10 4/4 6.44±1.10 9 20 4/4 19.17±2.09 4/4 13.69±2.32 4/4 10.21±1.71 4/4 6.50±1.03 13 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

3.2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天制備致敏血清）

14組：采用0.9 %氯化鈉注射液3次致敏，末次致敏后第14天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

2，6，10組：卵白蛋白劑量為5 mg/只時(shí)，4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %；2只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為50 %；1只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為10，20 mg/只時(shí)，各組均有4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %；3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為75 %；2只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為50 %。見表3。

表3 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

表3 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應(yīng)動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 2 5 4/4 12.93±2.92 4/4 9.82±1.53 2/4 3.72±4.00 1/4 1.29±2.39 6 10 4/4 14.23±3.70 4/4 10.87±1.20 3/4 6.78±4.50 2/4 3.60±4.03 10 20 4/4 16.06±3.33 4/4 11.06±1.24 3/4 6.54±4.23 2/4 3.71±4.07 14 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

3.3 5次致敏后被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第10天大鼠制備致敏血清）

15組：采用0.9 %氯化鈉注射液5次致敏，末次致敏后第10天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

3，7，11組：卵白蛋白劑量為5 mg/只時(shí)，4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %；3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為75 %；1只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為10 mg/只時(shí)，4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %；3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為75 %；1只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為20 mg/只時(shí)，4只動物在原液、1:2、1:4注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %；2只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為50 %。見表4。

表4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

表4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第10天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應(yīng)動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 3 5 4/4 13.37±2.38 4/4 10.17±2.80 3/4 5.64±4.16 1/4 1.99±3.69 7 10 4/4 16.10±2.88 4/4 12.82±1.99 3/4 6.07±4.17 1/4 1.81±3.40 11 20 4/4 17.13±2.65 4/4 12.08±1.88 4/4 10.90±1.90 2/4 3.98±4.31 15 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

3.4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天制備致敏血清）

16組：采用0.9 %氯化鈉注射液，5次致敏，末次致敏后第14天制備血清，4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

4，8，12組：卵白蛋白劑量為5，10，20 mg/只時(shí)，各組均有4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %；3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為75 %；各組4只動物在1:8注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。見表5。

表5 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

表5 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天制備致敏血清，）

注：n代表陽性反應(yīng)動物數(shù)，N代表動物總數(shù)

卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:8）n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 4 5 4/4 13.25±2.06 4/4 9.74±1.35 3/4 5.92±3.82 0/4 0 8 10 4/4 15.40±2.40 4/4 11.41±1.83 3/4 6.67±4.20 0/4 0 12 20 4/4 17.09±1.71 4/4 13.11±1.60 3/4 8.18±5.12 0/4 0 16 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:2）卵白蛋白+弗氏完全佐劑（1:4）

4 討論

被動皮膚過敏試驗(yàn)中影響免疫應(yīng)答的因素很多，如動物種屬、致敏劑量、致敏次數(shù)、致敏途徑、抗血清制備時(shí)間、是否添加佐劑等。大鼠已被廣泛用于過敏性評價(jià)試驗(yàn)[9]，SD大鼠是常用的非臨床研究用實(shí)驗(yàn)動物，有大量的生物學(xué)歷史數(shù)據(jù)，動物免疫原性較強(qiáng)，因此本研究選用SD大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。王金華等[10]研究表明，以卵白蛋白為致敏原進(jìn)行大鼠被動皮膚試驗(yàn)，在不加佐劑的條件下，激發(fā)后無藍(lán)斑出現(xiàn)，結(jié)果為陰性，但在加弗氏完全佐劑的條件下，結(jié)果為陽性。不同佐劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響也不同，戴學(xué)棟等[11]使用3種佐劑比較了SD大鼠被動皮膚過敏的反應(yīng)程度，陽性反應(yīng)率和藍(lán)斑直徑從大到小依次為氫氧化鋁＞百白破聯(lián)合疫苗＞弗氏完全佐劑，加入佐劑時(shí)，均能提高SD大鼠的敏感性，其中以氫氧化鋁效果最好。氫氧化鋁凝膠無市售成品，需自行配制[12]，方法繁瑣，而弗氏佐劑為油性佐劑[13]，無需配制，質(zhì)量穩(wěn)定，因此本試驗(yàn)致敏過程也選用弗氏完全佐劑，1:1與卵白蛋白混合后致敏。指導(dǎo)原則中，致敏給藥方法可選擇靜脈、腹腔或皮下注射等，共給藥3～5次，末次致敏后第10～14天制備致敏血清，大鼠抗體產(chǎn)生階段，致敏給藥方法多選用皮下注射[14-15]，有些藥物說明書中明確說明禁止皮下給藥，因此本試驗(yàn)研究了腹腔注射致敏途徑下，不同致敏劑量（5，10，20 mg/只）、致敏次數(shù)（3次、5次）、不同抗血清制備時(shí)間（末次致敏后第10天、第14天）等因素對大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)的影響。

結(jié)果表明，以卵白蛋白+弗氏完全佐劑作為抗原，卵白蛋白在5～20 mg/只劑量下，各組藍(lán)斑直徑與血清稀釋倍數(shù)呈遞減關(guān)系，藍(lán)斑直徑隨血清稀釋度的增加而減小，即原液注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑最大，其他注射點(diǎn)依次減小。所有動物在原液、1:2注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑，陽性反應(yīng)率為100 %，各組動物在1:4、1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑動物例數(shù)及陽性反應(yīng)率不同，卵白蛋白10，20 mg/只劑量下的陽性反應(yīng)率高于卵白蛋白5 mg/只劑量，但20 mg/只劑量下的原液注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑過大，邊緣不易區(qū)分，10 mg/只劑量下的各注射點(diǎn)藍(lán)斑邊緣清晰，較易區(qū)分。在卵白蛋白劑量相同，致敏次數(shù)及末次致敏后抗血清制備時(shí)間不同時(shí)，各組在原液、1:2注射點(diǎn)陽性反應(yīng)率并無明顯區(qū)別，均為100 %，但在1:4，1:8注射點(diǎn)陽性反應(yīng)率存在差異，特別是5次致敏后第14天制備抗血清組，所有動物在1:8注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。王沖等[16]研究發(fā)現(xiàn)，致敏8 d與致敏12～14 d的藍(lán)斑直徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組藍(lán)斑直徑并無明顯區(qū)別；井中旭等[17]研究發(fā)現(xiàn)，致敏效果與致敏次數(shù)不呈依賴關(guān)系，本研究結(jié)果也顯示致敏效果與致敏劑量相關(guān)，與致敏次數(shù)并無遞增關(guān)系，末次致敏后第10天制備抗血清的陽性反應(yīng)要優(yōu)于末次致敏后第14天制備抗血清的陽性反應(yīng)。藍(lán)繼奎等[18]研究表明，使用豚鼠進(jìn)行被動皮膚試驗(yàn)試驗(yàn)時(shí)，增加免疫次數(shù)能提高陽性反應(yīng)率，分析可能與動物種屬特異性有關(guān)。需要注意的是，大鼠腹腔注射致敏，由于佐劑的吸收速度慢，導(dǎo)致大鼠腹脹、腹腔內(nèi)腸黏膜粘連[10]，體重增長緩慢，致敏期間應(yīng)密切關(guān)注動物狀態(tài)。

綜上，大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)，致敏途徑為腹腔注射給藥時(shí)，推薦的方法為：SD大鼠連續(xù)隔日3次注射給予受試物與弗氏完全佐劑1:1混合乳液1 ml/只致敏，卵白蛋白致敏劑量10 mg/只，末次致敏后第10天取血制備抗血清?？寡灏丛海?:2，1:4，1:8倍比稀釋，大鼠背部皮膚皮內(nèi)分別注射0.1 ml各濃度抗血清被動致敏，24 h后靜脈注射與致敏劑量相同抗原激發(fā)。