劉 芳，楊釗楠，楊睿祺，王摸云，姚 焱，張 平

（1.植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

【研究意義】鉈（Tl）是一種劇毒的重金屬,隨著礦冶工業(yè)釋放入環(huán)境。土壤中鉈離子活躍，比砷(As)、汞(Hg)等重金屬更容易被農(nóng)作物吸收和積累，也更容易對(duì)人體健康造成危害［1-2］。我國(guó)是一個(gè)富鉈資源國(guó)家，《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》也將鉈列為重點(diǎn)防控的重金屬污染物之一。水稻作為我國(guó)的主要糧食作物，其生產(chǎn)安全關(guān)系到國(guó)家的糧食安全，提高產(chǎn)量的同時(shí)對(duì)水稻重金屬抗逆的研究受到較多關(guān)注［3-4］。我國(guó)是世界水稻種植大國(guó)，全國(guó)人口有近2/3以稻米為食。研究不同水稻品種根系形態(tài)及有機(jī)酸分泌能力與重金屬鉈吸收能力的關(guān)系，有助于篩選鉈吸收能力低的水稻品種適應(yīng)食品安全的需要，同時(shí)有助于深入了解植物根系對(duì)鉈吸收的機(jī)制。

【前人研究進(jìn)展】根系是水稻地上部分與地下部分物質(zhì)交換和信息交流的重要樞紐，植物的根系首先是與外源重金屬接觸的部位，重金屬通過(guò)根系的吸收進(jìn)入根系細(xì)胞內(nèi)。根是植物體與重金屬結(jié)合的關(guān)鍵部位，也是最易受重金屬毒性影響的部位，水稻苗期根系性狀如總根體積、總根面積、總根長(zhǎng)、分枝數(shù)的變化可以反映植物抗重金屬脅迫的強(qiáng)度［5］。重金屬脅迫導(dǎo)致根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞核裂解、線(xiàn)粒體數(shù)目減少、細(xì)胞壁腫脹等結(jié)果，而植物根系會(huì)通過(guò)增加邊緣細(xì)胞數(shù)目、提高細(xì)胞抗逆作用,維持較高水平的POD、CAT和SOD活性來(lái)對(duì)抗重金屬脅迫毒, 通過(guò)改變上述自身形態(tài)來(lái)應(yīng)對(duì)土壤中的重金屬等非生物逆境脅迫［6-8］。

【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于鉈脅迫與水稻根系性狀的關(guān)系未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，但有研究表明不同的植物根系影響植物獲得重金屬耐受性狀。作為植物和外界重金屬接觸的第一道屏障，植物的根系形狀有可能影響到植物對(duì)重金屬的吸收或是耐受。在重金屬環(huán)境下植物分泌有機(jī)酸是一種重要的耐性機(jī)制。根系通過(guò)分泌低分子量有機(jī)酸改變根際微生物的環(huán)境，同時(shí)有機(jī)酸可以與重金屬離子形成金屬配位體復(fù)合物，轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或者毒性較小的螯合形態(tài)，降低重金屬對(duì)植物體的危害［9］。植物根系分泌的有機(jī)酸，主要有檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸等［10］。不同植物在不同重金屬脅迫下有機(jī)酸分泌種類(lèi)不同，如鉛脅迫能夠持續(xù)促進(jìn)楊梅根系蘋(píng)果酸的分泌［11-12］，在黑麥草應(yīng)對(duì)Zn脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，根系分泌的草酸和酒石酸含量會(huì)隨著重金屬脅迫程度的增加而升高［13］；鎘脅迫不同莧菜品種根系分泌有機(jī)酸以檸檬酸和蘋(píng)果酸為主，分泌量均隨供鎘濃度增加而增加［14］。在根系分泌物中，有機(jī)酸通過(guò)對(duì)重金屬的螯合作用的外部排斥機(jī)制來(lái)降低植株對(duì)重金屬的吸收［15-16］，而重金屬的濃度也會(huì)影響水稻根際pH和有機(jī)酸的分泌，其中草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸含量的增加可以促進(jìn)水稻對(duì)重金屬的吸收［17］。本研究著重分析植物體的根系形狀和有機(jī)酸分泌對(duì)重金屬鉈吸收的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取華南地區(qū)18個(gè)水稻品種，利用水培試驗(yàn)的方法，比較各品種間鉈吸收量與根系長(zhǎng)度、根系數(shù)量關(guān)系，以及與有機(jī)酸分泌量的關(guān)系，明確水稻根系對(duì)鉈吸收的主要影響因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種18個(gè)，編號(hào)為V1～V18，均來(lái)自華南地區(qū)常規(guī)品種。

供試材料于2019年春季在廣州大學(xué)生化樓實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，18個(gè)水稻品種種子分格放入育苗盤(pán)中，加入雙蒸水漫過(guò)種子，遮光放入恒溫培養(yǎng)箱中。等種子露白后，使用鑷子調(diào)整水稻種子位置，保證萌發(fā)出的根系穿過(guò)育苗盤(pán)的間隙向下生長(zhǎng)。5 d后每升雙蒸水中加入10 mL大量元素儲(chǔ)備液（NH4NO3114.3 g/L、NaH2PO450.4 g/L、K2SO489.3 g/L、CaCl2110.8 g/L、MgSO4·7H20 410.8 g/L、MgSO4200 g/L），1.25 mL微量元素貯備液（MnCl2· 4H2O 1 500 mg/L、（NH4）6Mo7O24· 4H2O 74 mg/L、H3BO3934 mg/L、ZnSO4· 7H2O 35 mg/L、CuSO4· 5H2O 31 mg/L、FeCl3·6H2O (FeCl3) 7 700（4 621）mg/L、檸檬酸（水合物）11 900 mg/L）作為水稻受試材料的培養(yǎng)液。置于光照強(qiáng)度為350 μmol/m2·s，光照12 h/d，溫度28（±2）℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

鉈儲(chǔ)備液（Tl+1 g/L）：稱(chēng)取1.303 g TlNO3，用少許去離子水溶解并加入硝酸維持酸性環(huán)境，轉(zhuǎn)移至1 000 mL棕色容量瓶定容，備用。使用時(shí)，用雙蒸水稀釋重金屬母液至所需濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同水稻品種重金屬鉈吸收量測(cè)定 2019年春于廣州大學(xué)生化樓實(shí)驗(yàn)室，將12 d的幼苗浸泡在3.0 mmol/L Ca(NO3)2溶液（pH 6.0）中過(guò)夜后放入5 mg/L Tl+處理液中24 h。處理?xiàng)l件為光照強(qiáng)度350 μmol/m2·s，光照12 h/d，溫度28（±2）℃。24 h后取出供試水稻材料，利用移液器取出3 mL培養(yǎng)液通過(guò)原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定，記為處理后的培養(yǎng)液重金屬濃度，計(jì)算不同品種水稻鉈吸收量：

1.2.2 不同水稻品種根系性狀測(cè)定 培養(yǎng)24 h后取出植株放入10 mL無(wú)菌水中，收集6 h根系分泌物后，分組放在育苗盆中，照相機(jī)拍下根系性狀照片，利用imageJ統(tǒng)計(jì)測(cè)定根系長(zhǎng)度、根系數(shù)量。

1.2.3 不同水稻品種根系有機(jī)酸分泌量測(cè)定 將處理24 h的水稻苗移至無(wú)菌水中收集6 h根系分泌液。將含有根分泌物的無(wú)菌水放入-80℃冰箱6 h后，再放入真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥至無(wú)水分殘留，用1 mL K2HPO4緩沖液（0.01 mol/L，pH 2.75）溶解冷凍干燥后的殘余物，并用針式濾膜（0.45 μm）過(guò)濾至高效液相色譜儀（LC-20A，島津，日本）的進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測(cè)定。樣品測(cè)定采用外標(biāo)法，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。色譜條件為：色譜柱C18（150 mm×4.6 mm，d×5μm），流動(dòng)相由0.01 mol/L K2HPO4緩沖液（pH 2.75）和甲醇（體積比97：3）組成，流速為0.6 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作及標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：依據(jù)前期研究，水稻在鉈脅迫下根系分泌單一有機(jī)酸-草酸［18］。故準(zhǔn)確稱(chēng)取草酸100 mg，去離子水溶解定容至100 mL作為母液。將這些母液稀釋成不同倍數(shù)的稀釋液(4個(gè)梯度)分別上機(jī)測(cè)定, 每個(gè)樣品3次重復(fù), 測(cè)定其峰面積, 以平均峰面積(y)對(duì)濃度(x)作圖, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

每個(gè)水稻品種設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株苗。測(cè)定數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水稻品種重金屬鉈吸收量比較

重金屬鉈脅迫處理24 h后，18個(gè)水稻品種單位植株鮮重鉈吸收量可分為4個(gè)組，各組間吸收量存在差異，但組內(nèi)無(wú)差異：最高吸收量的V1、V2品種，單位植株鮮重鉈吸收量為112.01、107.79 mg/kg；較高吸收量的V3～V7品種，鉈吸收量為78.47～94.68 mg/kg；中等吸收量的V8～V12品種，鉈吸收量為64.06～73.22 mg/kg；較低吸收量的V13～V18品種，鉈吸收量為 55.29～63.81 mg/kg，鉈吸收量最高的V1品種是最低品種V18的2倍（圖1）。

圖1 鉈脅迫下不同水稻品種的吸收差異Fig.1 Absorption differences of different rice varieties under Tl treatment

2.2 不同水稻品種根系性狀與鉈吸收量的關(guān)系

為了分析水稻根系性狀與吸收量的關(guān)系，測(cè)量了18個(gè)品種水稻根系總長(zhǎng)度和根系數(shù)量，并建立了18個(gè)品種鉈吸收量與根總長(zhǎng)、鉈吸收量與根數(shù)的相關(guān)性（圖2）。如圖2A所示，根系總長(zhǎng)度與鉈吸收量線(xiàn)性相關(guān)方程為y=-0.0099x +75.767，相關(guān)系數(shù)r=-0.014，根系長(zhǎng)度與鉈吸收量相關(guān)性極低。如圖2B所示，根系數(shù)量與鉈吸收量線(xiàn)性相關(guān)方程為y=-0.0889x + 81.187，相關(guān)系數(shù)r=-0.135，表明根系數(shù)量與鉈吸收量相關(guān)性也很低。

圖2 根系性狀與鉈吸收量的相關(guān)性Fig.2 Correlation between root traits and thallium absorption

2.3 不同水稻品種有機(jī)酸分泌量比較

進(jìn)一步研究不同鉈吸收量的水稻品種根系外泌有機(jī)酸量與鉈吸收量的關(guān)系。選取兩個(gè)高吸收量品種V1和V2、兩個(gè)中等吸收量品種V6和V7、兩個(gè)低吸收量品種V13和V15測(cè)定根系外泌有機(jī)酸量。如圖3所示，6個(gè)品種草酸分泌量在1.46～ 2.11 mg/g 范圍內(nèi)，其中V2品種草酸分泌量最低，為1.46 mg/g，V15品種草酸分泌量最高，為2.11 mg/g。V2品種草酸分泌量顯著低于V13、V15品種草酸分泌量。

圖3 不同水稻品種草酸分泌量Fig.3 Oxalate secretion of different rice varieties

2.4 有機(jī)酸分泌量與鉈吸收量的關(guān)系

6個(gè)品種鉈吸收量與有機(jī)酸分泌量的關(guān)系如圖4所示，線(xiàn)性回歸方程為y=-0.0101x + 2.6295，相關(guān)系數(shù)r=-0.931（P＜0.01），說(shuō)明鉈吸收量與有機(jī)酸分泌量呈極顯著負(fù)相關(guān)。

圖4 不同水稻品種草酸分泌量與鉈吸收量的相關(guān)性Fig.4 Correlation between oxalate secretion and thallium absorption in different rice varieties

3 討論

重金屬脅迫導(dǎo)致根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞凋亡等結(jié)果，而植物根系會(huì)通過(guò)增加邊緣細(xì)胞數(shù)目、提高細(xì)胞抗逆作用來(lái)對(duì)抗重金屬脅迫, 水稻苗期根系性狀如總根體積、總根面積、總根長(zhǎng)、分枝數(shù)相應(yīng)也發(fā)生變化。相關(guān)研究表明植物根系會(huì)通過(guò)改變自身形態(tài)和分布來(lái)應(yīng)對(duì)土壤中的重金屬等非生物逆境脅迫［6-7］。本試驗(yàn)對(duì)18個(gè)水稻品種的鉈吸收能力進(jìn)行分析，18個(gè)水稻品種鉈吸收量在55.29～112.01 mg/kg范圍內(nèi)，最高吸收量約為最低吸收量的2倍，吸收量均值為74.86 mg/kg。依據(jù)鉈吸收能力分為存在差異的4個(gè)組對(duì)根系長(zhǎng)度和根數(shù)與鉈吸收能力的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。分析發(fā)現(xiàn)根系長(zhǎng)度和根數(shù)均與鉈吸收能力無(wú)相關(guān)性，根總長(zhǎng)和根數(shù)并不會(huì)影響水稻對(duì)鉈的吸收能力。在衡量水稻鉈吸收量方面，根長(zhǎng)和根數(shù)并不是主要的影響因素和指標(biāo)，還需要擴(kuò)展其他根系性狀進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

其他研究者對(duì)根系有機(jī)酸分泌和重金屬吸收量的研究中發(fā)現(xiàn)，植物受到重金屬脅迫時(shí)植物根系分泌出大量有機(jī)分泌物,根系分泌的一些有機(jī)酸可與重金屬離子形成配位化合物或發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，降低植物根際環(huán)境中有效態(tài)重金屬離子活性和移動(dòng)性［19］。在蕎麥［20］、小麥［21］、玉米［22］等農(nóng)作物的研究中發(fā)現(xiàn)根系分泌的有機(jī)酸如草酸蘋(píng)果酸等可以螯合重金屬離子從而降低植物對(duì)重金屬的吸收。根系有機(jī)酸在植物抗逆應(yīng)對(duì)重金屬脅迫中起到十分關(guān)鍵的作用［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)品種有機(jī)酸分泌量在1.46～2.11 mg/g范圍內(nèi)，最高與最低分泌量之間差異顯著。6個(gè)品種水稻有機(jī)酸分泌與鉈吸收量相關(guān)系數(shù)r=-0.931（P＜0.01），說(shuō)明鉈吸收量與有機(jī)酸分泌量呈極顯著負(fù)相關(guān)，有機(jī)酸分泌會(huì)降低水稻根系對(duì)鉈的吸收?？赡軝C(jī)制是水稻根系草酸分泌促進(jìn)草酸與鉈形成絡(luò)合物，降低水稻根系對(duì)鉈離子的吸收能力。這提示我們?cè)谘芯恐亟饘倌托苑矫娓鼞?yīng)該關(guān)注植物的生理生化特征，也指明根系有機(jī)酸可以作為水稻重金屬吸收能力的重要指示指標(biāo)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同水稻品種鉈處理24 h后吸收量在55.29～112.01 mg/kg范圍內(nèi)，鉈吸收能力上會(huì)有一定的差異。篩選出的6個(gè)水稻品種有機(jī)酸分泌量在1.46～2.11 mg/g范圍內(nèi)，有機(jī)酸分泌量與鉈吸收量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.931（P＜0.01），表明不同水稻品種鉈吸收量的差異與根系有機(jī)酸的分泌呈顯著負(fù)相關(guān)，有機(jī)酸分泌會(huì)降低水稻對(duì)鉈的吸收，而與根系長(zhǎng)度和根數(shù)性狀沒(méi)有相關(guān)性。