范 迪,張 寧,楊 燕,聞宏亮,秦 峰,劉 浩,范一靈

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所,上海 201203)

肌醇廣泛分布在動(dòng)植物體內(nèi),是動(dòng)物、微生物的生長(zhǎng)因子。肌醇作為一種“生物活素”參與體內(nèi)的新陳代謝活動(dòng)。在醫(yī)藥領(lǐng)域中,肌醇可以作為藥物治療肝硬化、脂肪肝、糖尿病等疾病[1]。肌醇有9種同分異構(gòu)體[2],其中具有光學(xué)異構(gòu)體的D-手性肌醇[3]最值得關(guān)注,其廣泛分布在蕎麥、苦瓜等食物中,量少但具有類胰島素作用[4],是當(dāng)下研究的新領(lǐng)域。高等動(dòng)物若缺乏肌醇,將會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯和毛發(fā)脫落等現(xiàn)象,因此食用富含肌醇的食品對(duì)人體健康也是尤為重要。在食品領(lǐng)域中,肌醇存在于許多天然食品中,也常作為營(yíng)養(yǎng)劑定量加入功能飲料、功能性乳粉等強(qiáng)化食品中。由于肌醇強(qiáng)化食品的食用人群通常包括嬰幼兒及免疫力低下等特殊人群,肌醇的添加量與安全性息息相關(guān),對(duì)其準(zhǔn)確定量尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外研究肌醇測(cè)定方法的文獻(xiàn)主要集中于高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-8]、氣相色譜法[9-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]和離子色譜法[13]等,而微生物法[14-17]是目前國(guó)標(biāo)方法GB 5009.270-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中肌醇的測(cè)定》[18]中測(cè)定食品中肌醇的仲裁法,但其檢測(cè)方法存在嚴(yán)重缺陷,選用的菌種釀酒酵母菌ATCC 9080無(wú)肌醇特異性,結(jié)果的重現(xiàn)性較差,無(wú)法準(zhǔn)確定量測(cè)定。

因此,本研究在通常用于維生素含量測(cè)定的菌種中選取葡萄汁酵母菌及釀酒酵母菌各三株,重新篩選出肌醇特異性菌種,并比較市售干粉培養(yǎng)基及自配肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基,對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,以期建立測(cè)定食品中肌醇含量的微生物方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肌醇測(cè)定培養(yǎng)基 青島日水生物科技有限公司、上海瑞楚生物科技有限公司、按配方成分實(shí)驗(yàn)室自配[18];麥芽浸粉液體培養(yǎng)基 上海瑞楚生物科技有限公司;肌醇標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMA,LRAA9145,99.5%;葡萄汁酵母菌CICC1465、CICC31161、ACCC20202、釀酒酵母菌 CICC32249、CICC32919、ATCC9080、ACCC20065 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。乳粉 雅培益力佳SR營(yíng)養(yǎng)配方粉;豬肉 愛森后腿精肉;薏米 上海忠緣弘食品有限公司;南瓜 上海歐尚超市有限公司;獼猴桃 新西蘭佳沛綠奇異果,佳沃(青島)果業(yè)有限公司;功能性飲料 紅牛維他命飲料有限公司。

UV2450分光光度計(jì) 日本島津公司;PYX-DHS-600-BS型恒溫培養(yǎng)箱 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SI-600R型振蕩培養(yǎng)箱 Jeiotech公司;HV-110型壓力蒸汽消毒器 Hirayama公司;酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司;打碎機(jī) 耐歐;勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活化培養(yǎng) 將菌種凍存管接種到麥芽浸粉液體培養(yǎng)基中，于(30±1) ℃培養(yǎng)2～3 d增菌活化(晃動(dòng)培養(yǎng)容器,至肉眼可見渾濁),再接種一環(huán)到麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上,于(30±1) ℃培養(yǎng)2～3 d后,制成貯備菌種,貯于4 ℃冰箱中,保存期不超過(guò)2周。臨用前接種到新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上。

使用的前一天將貯備菌種轉(zhuǎn)接到10 mL滅菌的麥芽浸粉液體培養(yǎng)基中,于(30±1) ℃培養(yǎng)20～24 h。取麥芽浸粉液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物,在無(wú)菌條件下2000 r/min離心15 min,棄去上清液,加入10 mL已滅菌的生理鹽水重新分散細(xì)胞,于旋渦混合器上快速混合均勻,離心15 min,傾去上清液。重復(fù)離心和清洗步驟三次。最后一次細(xì)胞分散液用生理鹽水懸浮,制成混懸液,備用。用分光光度計(jì),以氯化鈉溶液作空白,550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定該接種菌懸液的透光率,調(diào)整加入的菌液量或者加入一定量的氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在60%～80%,盡快使用。

與現(xiàn)行食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中直接從麥芽浸粉瓊脂斜面上制備菌懸液相比,本試驗(yàn)采用臨用前從貯備菌種轉(zhuǎn)接到麥芽汁肉湯,(30±1) ℃培養(yǎng)20～24 h的培養(yǎng)物來(lái)制備接種菌懸液,以此減少斜面洗菌過(guò)程中帶入瓊脂對(duì)后續(xù)處理過(guò)程中菌液濃度的透光率或吸光度測(cè)量造成的誤差,提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度。

1.2.2 菌種篩選 使用酶標(biāo)儀結(jié)合96孔板進(jìn)行菌種在無(wú)肌醇添加的培養(yǎng)基(S2)以及添加最高濃度肌醇的培養(yǎng)體系(S10)中培養(yǎng)0～48 h,分析比較菌種生長(zhǎng)的吸光度值隨時(shí)間的變化情況。

1.2.3 培養(yǎng)基比較 通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)市售肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基以及實(shí)驗(yàn)室自配肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基進(jìn)行比較,對(duì)選定菌株分別使用1.1中三種肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)的培養(yǎng)體系,在培養(yǎng)終點(diǎn)以標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)吸光度平均值對(duì)濃度作圖。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4.1 肌醇母液的配制 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品置于五氧化二磷的干燥器中干燥24 h以上,精密稱定50 mg(精確至0.1 mg)至250 mL容量瓶中,用二級(jí)水(后文提及的水均為二級(jí)水)溶解配制成0.2 mg/mL的肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;吸取5 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL棕色容量瓶中,制成10 μg/mL的肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液;吸取20 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液至100 mL容量瓶中,用水定容制成2 μg/mL的工作液。儲(chǔ)備液與中間液于4 ℃冰箱保存,工作液需臨用前配制。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作 取標(biāo)準(zhǔn)系列管S1～S10,每根試管加入肌醇測(cè)定培養(yǎng)基(青島日水)5 mL,其中S3到S10分別加入2 μg/mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL,將S1～S10加水補(bǔ)足體積至10 mL。最終配制成S3～S10濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)管,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管一式三份。

1.2.4.3 滅菌及培養(yǎng) 每支試管內(nèi)加入一粒玻璃珠(玻璃珠大小盡可能一致,防止菌種沉淀蓄積影響最終測(cè)定),蓋上試管帽,121 ℃滅菌5 min。將上述試管冷卻至30 ℃以下,除接種空白試管S1外,向其余各試管中滴加約150 μL CICC 1465菌懸液,加帽,渦旋混勻。將試管固定在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi),用約140～160 r/min振蕩速度,在(30±1) ℃黑暗振蕩培養(yǎng)約40～48 h。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后,未接種菌懸液的試管S1應(yīng)是澄清的,否則結(jié)果無(wú)效。最高濃度標(biāo)準(zhǔn)管相隔2 h測(cè)定的吸光度差值小于2%即為培養(yǎng)終點(diǎn)。取出所有培養(yǎng)管,用S1作空白,讀出S2的讀數(shù)。再以S2作空白,調(diào)節(jié)吸光度為0,依次讀出其他每支試管的吸光度。以肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)采用Logistic四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中肌醇含量。超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管范圍的結(jié)果需舍去,每只試管測(cè)得的濃度不超過(guò)該編號(hào)試管濃度均值的±15%,超過(guò)亦舍去,符合要求的試管數(shù)不少于所有四個(gè)編號(hào)待測(cè)液總管數(shù)的2/3,否則需重新實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 方法的應(yīng)用

1.2.5.1 樣品前處理 乳粉、薏米等需用研缽研磨、過(guò)篩(篩板孔徑0.3～0.5 mm);豬肉用打碎機(jī)制成肉糜;南瓜、獼猴桃等試樣需勻漿混勻;功能性飲料用前振搖混合。取含肌醇0.5～2.0 mg的試樣,乳粉、豬肉約1～2 g,薏米、南瓜、獼猴桃及功能性飲料約5～10 g置于250 mL錐形瓶中,加入80～100 mL 0.44 mol/L的鹽酸溶液混勻,以鋁箔紙封口,在滅菌釜中125 ℃水解1 h。取出,冷卻至室溫,加入2 mL氫氧化鈉溶液(600 g/L),冷卻至室溫,用10、1 mol/L的氫氧化鈉溶液或1、0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.2,轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中,定容至刻度。搖勻,過(guò)濾,收集濾液作為試樣提取液。調(diào)整稀釋度,使待測(cè)液肌醇的濃度在0.1～1.0 μg/mL范圍內(nèi)。

向待測(cè)液試管中加入水、試樣提取液和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基,從試管1到試管4分別加入試樣提取液1、2、3、4 mL,培養(yǎng)基各5 mL,每根試管均加水補(bǔ)足體積至10 mL,每個(gè)濃度試管一式三份。滅菌及培養(yǎng)過(guò)程同標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 肌醇的計(jì)算 試樣中肌醇含量計(jì)算公式:

式中:M為試樣中肌醇的含量,mg/100 g;m為樣品質(zhì)量,g;Cx為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得的肌醇濃度(X)折算每支試管中加入的待測(cè)液體積獲得肌醇含量所得的平均值,μg;f為樣液稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)上述計(jì)算公式測(cè)得試樣中的肌醇含量,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合采用ELISA軟件的Logistic四參數(shù)方程并進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)結(jié)果偏差以RSD%表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

菌種篩選結(jié)果見圖1,其中每一小格分別為相應(yīng)菌種生長(zhǎng)的吸光度值隨時(shí)間(t/h)的變化情況。結(jié)果表明除CICC 32249和CICC 1465兩株酵母菌,其余菌種的肌醇特異性均較差。因此,初步篩得CICC 32249和CICC 1465兩株酵母菌,其生長(zhǎng)對(duì)肌醇需求具有特異性。

圖1 肌醇特異性菌株生長(zhǎng)比較

由圖1可知,CICC 1465在48 h內(nèi)已經(jīng)能夠達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái),而CICC 32249吸光度值仍在增長(zhǎng),還未達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái)。進(jìn)一步比較釀酒酵母CICC 32249和葡萄汁酵母CICC 1465對(duì)于本方法的適用性。以肌醇對(duì)照品作為質(zhì)控樣品,分別以兩株菌進(jìn)行測(cè)定,見表1,CICC 32249實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果與理論值偏差達(dá)到25%以上,而CICC 1465實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果與理論值偏差小于8%,證明CICC 1465在微生物法中測(cè)定肌醇更準(zhǔn)確,且生長(zhǎng)時(shí)間較CICC 32249更短,因此最終選擇葡萄汁酵母CICC 1465作為試驗(yàn)菌種。

表1 CICC 32249和CICC 1465的肌醇測(cè)定比較

2.2 培養(yǎng)基比較結(jié)果

如圖2,結(jié)果表明以上三種培養(yǎng)基并無(wú)明顯差異,因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)均選用市售青島日水肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基。

圖2 肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基的比較

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

本方法根據(jù)菌液吸光度與肌醇濃度的曲線關(guān)系,以肌醇標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),運(yùn)用ELISA軟件采用Logistic四參數(shù)進(jìn)行擬合，使曲線方程與標(biāo)準(zhǔn)管每一個(gè)濃度點(diǎn)更加契合,擬合效果優(yōu)于線性等其他擬合方式,結(jié)果更準(zhǔn)確,見圖3。肌醇含量回歸方程為:Y=(1.21585-0.0208)/[1+(X/0.3364)-2.96406]+0.0208,R2>0.996。其中,X為肌醇濃度,μg/mL;Y為吸光度值。曲線范圍為:0.1～1.0 μg/mL。

圖3 肌醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 將富含肌醇的功能性飲料、強(qiáng)化乳粉和天然食品豬肉、南瓜、獼猴桃、薏米各取平行樣兩份,分別配制成四個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度三份平行,按照1.2.5.1項(xiàng)下處理,測(cè)定肌醇含量,進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2 各基質(zhì)中肌醇的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

強(qiáng)化肌醇的乳粉、功能飲料和天然食品中肌醇的含量,同一樣品兩份平行間相對(duì)偏差均小于2%,結(jié)果表明該方法的精密度良好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取適量樣品,分別配制6份供試品,進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3,結(jié)果均在6%以內(nèi),表明該方法的重復(fù)性良好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.3 回收率實(shí)驗(yàn)及檢出限 對(duì)六種基質(zhì)的樣品分別以1∶1進(jìn)行加標(biāo)回收,重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算平均回收率,見表4,結(jié)果均在94%～107%之間,RSD小于10%,回收率評(píng)價(jià)較好。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)空白管重復(fù)測(cè)定20次得到方法的檢出限為0.015 μg/mL,以取樣1 g,定容至250 mL計(jì),方法檢出限為0.375 mg/100 g。

3 結(jié)論

本研究在原有國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上,篩選出對(duì)肌醇特異性更強(qiáng)的菌種葡萄汁酵母菌(CICC 1465),相比此方法長(zhǎng)久以來(lái)選用的葡萄汁酵母菌(ATCC 9080)具有創(chuàng)新性。通過(guò)優(yōu)化后續(xù)試驗(yàn)條件對(duì)強(qiáng)化食品及天然食品進(jìn)行肌醇含量檢測(cè),精密度相對(duì)偏差小于2%,重復(fù)性小于6%,回收率在96%～107%之間,方法學(xué)評(píng)價(jià)良好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。方法檢出限為0.375 mg/100 g,遠(yuǎn)低于現(xiàn)行國(guó)標(biāo)檢出限12.5 mg/100 g。可用于檢測(cè)肌醇含量較低的食品,與其他檢測(cè)方法復(fù)雜的前處理過(guò)程相比,微生物法具有操作簡(jiǎn)單,成本較低,靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究可以為食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法修訂工作提供參考和支持。