楊婷婷,李佳怡,張彥青,2,*,解軍波,2,王 輕,2

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

酸棗仁是鼠李科植物酸棗(ZiziphousjujubaMill. Var.Spinosa(Bunge)Hu. Et H.f. Chou)的干燥成熟種子,具有鎮(zhèn)靜安眠、補(bǔ)肝寧心等功效[1],黃酮類化合物是其主要化學(xué)成分[2-3]。大量研究證明,異牡荊素是具有較強(qiáng)抗氧化活性的黃酮類化合物[4],可通過緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激來減輕過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[5]。

目前,酸棗仁異牡荊素的主要提取方法有浸提法和乙醇加熱回流法[6],但是浸提法提取時(shí)間太長,而乙醇加熱回流法設(shè)置溫度太高。近年來,超聲提取技術(shù)因利用空化、機(jī)械和熱效應(yīng)的優(yōu)勢被廣泛用于提取化合物,具有得率高、提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn),從而提高工作效率[7-8]。目前,超聲輔助提取技術(shù)被廣泛用于提取中藥化學(xué)成分[9-10],展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。近幾年,關(guān)于植物中異牡荊素提取的研究較多且得率都比較低[11-12],同時(shí),關(guān)于超聲技術(shù)用于優(yōu)化酸棗仁黃酮化合物異牡荊素提取方面的研究報(bào)道尚少。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)影響異牡荊素得率的主要因素及其交互作用進(jìn)行分析探討,優(yōu)化超聲輔助提取技術(shù)的最佳提取工藝參數(shù),以期建立一種實(shí)用有效的異牡荊素提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 天津薊縣;異牡荊素對(duì)照品 實(shí)驗(yàn)室自制,純度>98%;乙腈、冰醋酸、無水乙醇、石油醚 天津市鑫橋化工有限公司;去離子水 實(shí)驗(yàn)室自制。

SB25-12 DTD型數(shù)控超聲波清洗器 寧波新芝生物科技有限公司;V-700型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;FA1004Max 100 g型電子天平 上海精科天平有限公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司;FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent1100色譜工作站、二極管陣列檢測器 安捷倫科技中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁脫脂 酸棗仁50 ℃干燥24 h后粉碎至60目,以液固比3∶1 (mL/g)加入石油醚,加熱回流脫脂兩次,第一次70 ℃加熱回流3 h,第二次70 ℃加熱回流2 h[13]。靜置冷卻,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在55 ℃下減壓回收石油醚,合并脫脂粉末于通風(fēng)廚,揮干后常溫放置備用。

1.2.2 超聲輔助提取工藝 精密稱定脫脂酸棗粉末5.00 g于具塞三角瓶中,以一定料液比加入乙醇,然后放置在已達(dá)到一定實(shí)驗(yàn)溫度的數(shù)控超聲波清洗器中,在一定功率下超聲一定時(shí)間,開始超聲提取。超聲停止后,離心過濾得異牡荊素提取物,測定異牡荊素得率。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 大量研究證明,影響異牡荊素得率的主要因素有超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比[14-17]。固定提取因素的條件:超聲時(shí)間50 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲功率300 W,液固比15∶1 mL/g,在其他條件不變的情況下,改變其中一個(gè)因素考察其對(duì)異牡荊素得率的影響。超聲功率考察水平有100、200、300、400、500 W,超聲時(shí)間考察水平有30、40、50、60、70 min,液固比考察水平有5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)考察水平有40%、50%、60%、70%、80%。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[18]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,篩選出了超聲功率、液固比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)四個(gè)影響因素的水平,以這四個(gè)因素為自變量,異牡荊素得率(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 異牡荊素得率的測定

1.2.5.1 高效液相色譜條件 色譜條件:ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(千分之一醋酸)=18∶72 (V/V);體積流量:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL,檢測波長:335 nm[11]。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 為得到異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)曲線,精密稱取異牡荊素對(duì)照品50.0 mg,用18%乙腈溶解,定容于50 mL容量瓶中,分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5、2、2.5、3 mL于10 mL量瓶中,18%乙腈定容,搖勻即配制濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL對(duì)照品溶液,HPLC法(安捷倫1200系列高效液相色譜系統(tǒng))檢測得峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo),得到異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=1.3901C+3.98,R2=0.9993,具有良好的線性關(guān)系。

1.2.5.3 異牡荊素得率的計(jì)算 所有提取樣品經(jīng)0.45 μm微膜過濾,進(jìn)行HPLC檢測,將峰面積代入異牡荊素標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到對(duì)應(yīng)濃度C,再將C帶入下式計(jì)算得異牡荊素得率。Y異牡荊素得率(%)=(CV×稀釋倍數(shù))/m×100,其中V是提取液的體積,m是脫脂后原料干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理軟件GraphPad Prism 5TM和SPSS,繪圖軟件GraphPad Prism 5TM,響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析軟件Design-Expert,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響 超聲功率對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響如圖1。由圖可知,異牡荊素得率隨著超聲功率的升高呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢,在400 W時(shí)得率達(dá)到最大值0.202%,隨后超聲功率繼續(xù)增加,破壞了異牡荊素的穩(wěn)定性,導(dǎo)致溶出的異牡荊素大量降解,因此得率降低,超聲功率500 W時(shí),得率僅為0.151%。因此選擇超聲功率300、400和500 W三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 超聲功率對(duì)異牡荊素得率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響 超聲時(shí)間對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響(圖2)表明,隨著時(shí)間的延長,異牡荊素得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,50 min得率為0.170%,在60 min時(shí)出現(xiàn)最大值0.228%,超過60 min后,超聲時(shí)間過長,異牡荊素被降解,因此得率呈現(xiàn)懸崖式下降,超聲持續(xù)到70 min得率僅為0.115%。因此,選擇超聲時(shí)間為50、60和70 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)異牡荊素得率的影響

2.1.3 液固比對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響 超聲功率對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響如圖3。由圖3可知,異牡荊素得率隨著液料比的增加呈先增大后降低的趨勢,液固比為5∶1 mL/g時(shí),得率為0.106%,液固比15∶1 mL/g的得率最大,為0.195%,在液料比為15∶1～25∶1 mL/g 處,異牡荊素幾乎已全部溶出,過高的溶劑體積使溶出的異牡荊素被不斷稀釋,從而導(dǎo)致得率緩慢下降到25∶1 mL/g的0.187%?？紤]到節(jié)約原料,選擇液固比為10∶1、15∶1和20∶1 mL/g 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 液固比對(duì)異牡荊素得率的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酸棗仁異牡荊素得率的影響 從圖4可以看出,乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)異牡荊素得率的影響比較大,40%乙醇處異牡荊素得率為0.146%,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,異牡荊素得率逐漸增大,在70%處,得率急速增到0.231%又急速降低,過高的乙醇濃度會(huì)破壞黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致異牡荊素分解,從而導(dǎo)致得率降低,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)得率僅為0.142%。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%和80%三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)異牡荊素得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)表2中的因素與水平值,建立四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,擬合出的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of the regression model

Y=0.23+5.5×10-3A+8.25×10-3B+0.012C+0.012D-5×10-4AB-2×10-3AC+2.5×10-3AD+4.5×10-3BC+3.25×10-3BD+4×10-3CD-0.033A2-0.018B2-0.019C2-0.018D2。

該模型的擬合程度達(dá)極顯著水平(p<0.0001),說明模型有意義。失擬項(xiàng)不顯著(p=0.288),表明該模型擬合程度良好,與試驗(yàn)值的誤差相對(duì)較小。模型決定系數(shù)(R2=0.9755)較高,可以用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測[19-20]。此外模型變異系數(shù)(CV)=2.60%,表明該試驗(yàn)值精密可靠,可以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。A(超聲功率)、B(液固比)、C(超聲時(shí)間)和D(乙醇體積分?jǐn)?shù))對(duì)異牡荊素得率都有極顯著影響(p<0.01),二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。各因素的影響重要性依次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>液固比>超聲功率。

2.2.3 交互作用分析 通過用Design-expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)三維響應(yīng)面來反映最佳區(qū)域,固定兩個(gè)影響因素為中值,代入模型方程考察其余兩個(gè)因素間的相互作用[21],根據(jù)方程做出三維響應(yīng)面圖和等高線圖,通過判斷三維圖的坡度和等高圖的圓形程度,從中選取得率最佳的提取條件[22],結(jié)果見圖5。

圖5 兩兩因素交互作用對(duì)異牡荊素得率影響的響應(yīng)面圖

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理分析圖5可知,六組三維圖的彎曲度都比較大,說明隨著超聲功率、超聲時(shí)間、液固比和乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素水平的變化,異牡荊素提取效果也呈現(xiàn)顯著性地先升高再逐漸減小的變化趨勢,但兩兩因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值沒有顯著的影響(p>0.05)。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由響應(yīng)面軟件得到的最佳提取工藝條件為:超聲功率為419.00 W,液固比15.5∶1 mL/g,超聲時(shí)間60.20 min和乙醇體積分?jǐn)?shù)73.7%。預(yù)測最佳目標(biāo)值為0.236%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的具體情況,改進(jìn)最佳提取條件為:超聲功率419 W,液固比16∶1 mL/g,超聲時(shí)間61 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)73.70%。測得異牡荊素得率的實(shí)際值為0.241%±0.0126%,與預(yù)測得率的0.236%相對(duì)誤差為2.075%,且t檢驗(yàn)的結(jié)果差異不顯著(p>0.05),證明模型理論預(yù)測值與實(shí)際值擬合效果良好。

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助法提取酸棗仁中的異牡荊素,利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超聲功率、液固比、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)異牡荊素得率的影響作用都比較明顯。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,建立四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方法對(duì)異牡荊素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化以及驗(yàn)證。結(jié)果表明各因素對(duì)異牡荊素得率的影響大小順序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>液固比>超聲功率。優(yōu)化提取工藝條件為:超聲功率419 W,液固比16∶1 (mL/g),超聲時(shí)間61 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)73.70%。實(shí)際得率為0.241%±0.0126%,與模型預(yù)測值0.236%相符良好。因此,本試驗(yàn)建立的二次多項(xiàng)回歸方程模型能夠良好地預(yù)測各因素與響應(yīng)面之間的變化關(guān)系。