李雨楓，薛思雯，陳 星，李 鳴，徐幸蓮*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095）

肌肉蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富，包含人體所需的所有必需和非必需氨基酸，其消化率遠(yuǎn)高于大豆蛋白等植物蛋白，是一種優(yōu)質(zhì)的人體蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑[1-2]。肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MP）是肌肉蛋白中最主要的蛋白質(zhì)，大約占肌肉蛋白的50%左右[3]。這部分蛋白質(zhì)由于在高鹽濃度溶液中易溶解，故被稱(chēng)為鹽溶蛋白[4]。在肉品加工中，MP的溶解性會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、乳化性等功能特性，所以具有特殊的功能性。但是相比于牛奶、大豆蛋白，肌肉蛋白在食品加工中利用程度不高，主要原因是其在水或者低離子強(qiáng)度溶液中不溶解，從而導(dǎo)致肉制品形態(tài)單一。近年來(lái)，為了提高M(jìn)P的溶解性，超聲波[5]、蛋白糖基化[6-7]和低鹽洗脫[8]等新技術(shù)被廣泛研究。

高壓均質(zhì)（high pressure homogenization，HPH）是一種運(yùn)用于食品領(lǐng)域中的新型加工技術(shù)，物料在高壓作用下，通過(guò)具有特殊內(nèi)部構(gòu)造的均質(zhì)腔，同時(shí)受到高速剪切、高頻振蕩、空穴作用和對(duì)流碰撞等物理作用，使物料的性質(zhì)發(fā)生一定變化，從而達(dá)到均質(zhì)、改善加工特性和殺菌的效果[9-10]。目前已有研究表明，HPH的物理作用能夠打破MP高度交聯(lián)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，對(duì)MP進(jìn)行物化改性，從而提高M(jìn)P的水溶性[11]。同時(shí)，不同次數(shù)的HPH處理可以對(duì)植物蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)、理化特性產(chǎn)生不同的影響，從而提高植物蛋白在食品加工中的利用程度[12-18]。但關(guān)于HPH處理次數(shù)對(duì)MP在水中溶解性的影響及其調(diào)控規(guī)律尚不清楚。作為一種人體蛋白質(zhì)的重要補(bǔ)充來(lái)源，開(kāi)展HPH對(duì)MP在水中溶解性的調(diào)控規(guī)律研究很有必要。本實(shí)驗(yàn)對(duì)MP懸濁液進(jìn)行不同次數(shù)的HPH處理，并對(duì)處理后的MP水溶液溶解性、穩(wěn)定性、粒徑、流變特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況進(jìn)行初步探究，以期為肉蛋白的在食品中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍雞胸肉 江蘇省南京市蘇果超市。

三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、牛血清白蛋白、聚乙二醇辛基苯基醚、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)R250、溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇、五水硫酸銅、四水合酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、疊氮化鈉（均為分析純） 南京瑞翼特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GM 200粉碎儀 德國(guó)Retsch儀器有限公司；T25勻漿機(jī) 德國(guó)IKA儀器有限公司；Mini Debee超高壓均質(zhì)機(jī)美國(guó)Bee儀器有限公司；Z5（130 μm）金剛石噴嘴美國(guó)Genizer儀器有限公司；J26SXP落地式離心機(jī) 美國(guó)Beckman儀器有限公司；Nano ZS 90納米激光粒度儀英國(guó)馬爾文儀器有限公司；MCR 301流變儀 澳大利亞Anton Paar有限公司；Dimension Icon原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM） 德國(guó)Bruker有限公司；Imager Scanner III EU-88掃描儀 日本Epson公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

根據(jù)Stefansson[8]、Chen Xing[11]等的方法稍作修改，采用水洗法提取MP。將冷凍的雞胸肉在4 ℃下解凍12 h后，去除結(jié)締組織和脂質(zhì)，將雞胸肉在粉碎儀中以3 000 r/min粉碎10 s，用4 ℃的去離子水將碎肉（100 g）洗滌4 次，用勻漿機(jī)均質(zhì)2 min。將每次洗滌后的肉糜與水（1∶100，m/V）靜置10 min，在4 ℃下18 000×g離心20 min，回收沉淀物，在第3次洗滌時(shí)，將離心前的懸濁液用3 層紗布過(guò)濾以去除結(jié)締組織和脂質(zhì)。最后一次洗滌、離心后的沉淀物即為MP。所有操作都在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.3.2 HPH處理

提取后的MP質(zhì)量濃度為60 mg/mL，在MP中加入4 ℃去離子水將MP質(zhì)量濃度稀釋至5 mg/mL備用，8 000 r/min勻漿處理2 min。用配備有Z5型號(hào)金剛石噴嘴的高壓均質(zhì)機(jī)將樣品在103MPa壓力下分別處理1～6 次，以未經(jīng)過(guò)HPH處理的樣品為對(duì)照組，處理后將所有樣品裝入無(wú)菌袋保存，為了防止微生物污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的疊氮化鈉作為防腐措施[19]，所有樣品置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 溶解度的測(cè)定

溶解度的測(cè)定根據(jù)Chen Xing等[11]的方法，并略作修改。將經(jīng)過(guò)處理后的樣品在4 ℃條件下，使用離心機(jī)在20 000×g下離心20 min，收集上清液，溶解度以離心后上清液MP質(zhì)量濃度相對(duì)于離心前MP懸濁液質(zhì)量濃度的百分比表示，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.4 穩(wěn)定性的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)處理后的MP水溶液在4 ℃條件下放置9 d，在第0、3、6、9天分別測(cè)定其溶解度并進(jìn)行記錄，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.5 SDS-PAGE分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）采用Khiari等[20]的方法。將10 μL經(jīng)過(guò)20 000×g離心后的上清液樣品、經(jīng)過(guò)HPH處理的MP懸濁液樣品和Marker同時(shí)加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～20%預(yù)制分離膠上。使用Mini-PROTEAN II System Cell以120 V恒壓電泳1 h。待條帶跑至電泳板的最底部時(shí)停止電泳，將膠剝離取出，放置在染色液中染色1 h，然后放入乙酸脫色液中脫色11～12 h，及時(shí)更換脫色液。待電泳凝膠的底色脫為透明時(shí)，使用Imager Scanner III掃描儀掃描染色的凝膠，并且通過(guò)Quantity One軟件進(jìn)行條帶處理分析。

1.3.6 粒徑分布的測(cè)定

根據(jù)Chen Xing等[11]的方法并略作修改。使用Nano ZS 90納米激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定。將通過(guò)0～6 次HPH處理的MP水溶液稀釋10 倍后，分別置于1 cm光程石英比色杯中，并在25 ℃條件下進(jìn)行測(cè)量，得到平均粒度和粒徑分布。

1.3.7 流變特性的測(cè)定

使用MCR30流變儀獲得樣品的流動(dòng)曲線[21]。測(cè)量間距0.5 mm，測(cè)量前將樣品在流變儀上平衡30 s以獲得25 ℃的理想溫度，在剪切速率1～1 000 s－1范圍內(nèi)記錄黏度。

1.3.8 AFM觀察

參考Zhong Jian等[22]的方法，通過(guò)使用配備有Si3N4懸臂式掃描儀的AFM獲得以輕敲模式掃描的AFM圖像（SCANASYST-AIR模式、共振頻率70 kHz、彈簧系數(shù)0.4 N/m），實(shí)驗(yàn)在室溫（25 ℃）下進(jìn)行。線性?huà)呙杷俾试? Hz下進(jìn)行優(yōu)化，掃描分辨率為每行512 個(gè)樣本。用超純?nèi)ルx子水將樣品稀釋至0.05 mg/mL，并將5 mL MP水溶液澆鑄在新鮮切割的云母上，并使其在空氣中干燥20 min，然后進(jìn)行AFM觀察。所有高度圖像都使用Nanoscope分析軟件進(jìn)行“平滑”處理。

1.3.9 表面疏水性的測(cè)定

MP在水中表面疏水性的測(cè)定根據(jù)Cao Yingying等[23]的方法進(jìn)行修改。使用ANS測(cè)試表面疏水性。向2 mL樣品（1 mg/mL）中加入10 μL 15 mmol/L ANS溶液（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）。避光孵育20 min，使用380 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和410～570 nm的發(fā)射波長(zhǎng)在5 nm/s掃描速率下測(cè)定熒光強(qiáng)度。表面疏水性用熒光強(qiáng)度（a.u.）表示。

1.3.10 活性巰基含量的測(cè)定

根據(jù)Chen Xing等[24]的方法進(jìn)行改進(jìn)，測(cè)定水中MP的活性巰基基團(tuán)含量。將MP水溶液用去離子水稀釋到1 mg/mL，將50 μL 5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.0）中加入4 mL樣品（1 mg/mL），并在25 ℃條件下孵育20 min，并通過(guò)Microplate Reader分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合物的吸光度。使用13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)按下式計(jì)算巰基含量。

式中：A412nm為吸光度；D為稀釋倍數(shù)；ρ為肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。每個(gè)壓力水平重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.11 圓二色光譜分析

使用Jasco J-715分光偏振計(jì)測(cè)量圓二色光譜（circular dichroism，CD）。用去離子水將MP水溶液調(diào)整到0.3 mg/mL，隨后轉(zhuǎn)移至0.1 cm光徑的石英池中。在調(diào)節(jié)溫度下以20 nm/min的掃描速率在200～240 nm的范圍內(nèi)測(cè)量分子橢圓率。使用Jasco J-715旋光偏振計(jì)提供的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算程序測(cè)定α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，使用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為顯著差異。采用Origin 2017軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液溶解度的影響

圖1 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液溶解度的影響Fig. 1 Effect of HPH cycle on aqueous solubility of MPs

由圖1可知，未經(jīng)HPH處理的MP懸濁液呈現(xiàn)較低的溶解度（23.6%），說(shuō)明MP在水中的溶解性較差[5,11]。由于HPH在處理過(guò)程中會(huì)對(duì)物料產(chǎn)生高速剪切、空穴作用、對(duì)流撞擊等機(jī)械作用，促使MP蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)更多地暴露出來(lái)，導(dǎo)致表面電荷增加，從而提高其溶解性。同時(shí)，Chen Xing等[11]也通過(guò)103 MPa、2 次HPH處理實(shí)現(xiàn)了MP在水或低離子強(qiáng)度溶液中的溶解。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著處理次數(shù)的增加，MP水溶液的溶解度持續(xù)上升，在4 次處理時(shí)達(dá)到最高（96.1%）。當(dāng)處理次數(shù)達(dá)到到5～6 次時(shí)，MP溶解度增長(zhǎng)放緩，甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)，此時(shí)MP溶解度與經(jīng)過(guò)4 次處理的樣品不存在明顯差異。原因可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在經(jīng)過(guò)多次HPH處理后進(jìn)一步展開(kāi)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間接觸增加，在疏水作用下，蛋白質(zhì)重新聚集，使得MP溶解度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)[18]。

2.2 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液穩(wěn)定性的影響

穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)一種很重要的特性，良好的穩(wěn)定性有利于蛋白質(zhì)在食品加工中的進(jìn)一步利用。將HPH處理后的MP水溶液在4 ℃條件下靜置9 d，每隔3 d測(cè)定其溶解度，與未經(jīng)HPH處理的樣品進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)HPH處理次數(shù)為1～3 次時(shí)，與第0天相比，樣品的溶解度在第9天時(shí)顯著下降（P＜0.05），其中經(jīng)過(guò)1 次HPH處理的MP水溶液在第9天時(shí)僅能保持40.0%的溶解度，原因可能是由于處理次數(shù)較少，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)并未完全被破壞，蛋白質(zhì)顆粒大小不一，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同蛋白質(zhì)分子的顆粒大小以及介質(zhì)的密度差會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象[11]，導(dǎo)致水溶液穩(wěn)定性較差。當(dāng)HPH處理4～6 次時(shí)，水溶液在第9天時(shí)仍然保持較好的溶解性（90%以上），溶解度與靜置初期相比沒(méi)有明顯下降。這可能是由于隨著HPH處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步被完全破壞成較小的顆粒，從而提高了MP水溶液的均勻性，在貯藏過(guò)程中保持了較好的穩(wěn)定性[12]。其中當(dāng)HPH處理次數(shù)為5～6 次時(shí)，與處理4 次相比，穩(wěn)定性較差，隨著處理次數(shù)增加，蛋白質(zhì)可能會(huì)進(jìn)一步聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子在MP水溶液中分布不均，從而影響其穩(wěn)定性。

圖2 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Effect of HPH cycle on stability of MPs in water

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖3 HPH處理后MP水溶液SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of MPs aqeuous solutions undergoing different HPH cycles

由圖3可知，未經(jīng)HPH處理和經(jīng)過(guò)HPH處理的樣品蛋白條帶中肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈較為明顯。經(jīng)過(guò)離心后的未經(jīng)HPH處理的樣品上清液幾乎看不到蛋白條帶（泳道2），說(shuō)明MP在水中具有不溶性，這與之前的相關(guān)研究結(jié)果[11,24]相符，證明MP不溶于水。經(jīng)過(guò)20 000×g離心后，HPH處理的樣品上清液仍然保留了部分蛋白質(zhì)（泳道4、6、8、10、12和14），并且與未經(jīng)離心的蛋白溶液條帶相比沒(méi)有明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明HPH實(shí)現(xiàn)MPs在水中溶解的同時(shí)，MP沒(méi)有發(fā)生明顯的水解現(xiàn)象，因此HPH實(shí)現(xiàn)MP在水中的溶解并不是通過(guò)多肽的斷裂或縮短引起的[11,25]。

2.4 HPH處理次數(shù)對(duì)MP在水中顆粒特性的影響

圖4 HPH處理次數(shù)對(duì)MP在水中粒徑分布的影響Fig. 4 Effect of the HPH cycle on particle size distribution of MPs in water

圖5 HPH處理次數(shù)對(duì)MP在水中平均粒徑的影響Fig. 5 Effect of HPH cycle on Z-average of MPs in water

如圖4、5所示，與未經(jīng)處理的樣品平均粒徑（1 252 nm）相比，經(jīng)過(guò)HPH處理后MP在水中的平均粒徑顯著下降（P＜0.05），均為400 nm以下，同時(shí)呈現(xiàn)雙峰分布，粒徑分布變得更加均勻。當(dāng)樣品在高壓作用下通過(guò)均質(zhì)機(jī)時(shí)，高度有序的MP結(jié)構(gòu)被破壞，施加的機(jī)械力對(duì)其產(chǎn)生隨機(jī)破裂、解聚或解離等作用[26]，導(dǎo)致粒徑減小。HPH處理1～4 次時(shí)，樣品的平均粒徑隨著處理次數(shù)的增加逐漸變小，分別為327、251、227、204 nm，同時(shí)粒徑分布峰均向小粒徑峰移動(dòng)，其中在HPH處理4 次時(shí)粒徑最小。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，處理組的峰與空白組的間距增大，并且在第4次時(shí)達(dá)到最大，推測(cè)是由于樣品循環(huán)進(jìn)行HPH處理的過(guò)程中，HPH對(duì)樣品施加反復(fù)的物理作用，樣品在循環(huán)通過(guò)噴嘴時(shí)，蛋白顆粒的結(jié)構(gòu)持續(xù)破壞。當(dāng)HPH處理次數(shù)達(dá)到4 次及以上時(shí)，其粒徑分布峰開(kāi)始向右移動(dòng)，表現(xiàn)出向大粒徑峰分布的趨勢(shì)，同時(shí)，其平均粒徑的降低不再顯著（P＞0.05）。有研究表明，當(dāng)HPH的壓力過(guò)高、均質(zhì)次數(shù)過(guò)多時(shí)，可能會(huì)引起蛋白質(zhì)的重新聚合，導(dǎo)致粒徑增大[11,17,27-28]。

2.5 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液流變特性的影響

由圖6可知，經(jīng)過(guò)HPH處理后，MP水溶液的表觀黏度顯著降低，其中未經(jīng)HPH處理的樣品與HPH處理1～2 次的樣品表觀黏度都隨著剪切速率的增加而表現(xiàn)出剪切變稀的現(xiàn)象，呈現(xiàn)非牛頓流體狀態(tài)，說(shuō)明蛋白溶液中還保留著一些完整的MP片段，具有高黏度；其中大的蛋白顆粒以及大分子互相糾纏在一起，增加了溶液流動(dòng)的阻力；隨著剪切速率的增加，蛋白纖維之間的連接被破壞，摩擦阻力減小，導(dǎo)致黏度下降。當(dāng)處理次數(shù)為3～6 次時(shí)，可以看到與前3 組相比，表觀黏度顯著下降，在剪切速率范圍內(nèi)呈現(xiàn)牛頓流體性質(zhì)。可能是由于HPH次數(shù)增加時(shí)，蛋白粒徑減小，流動(dòng)性增加，所以呈現(xiàn)較低的表觀黏度。HPH處理6 次時(shí)，蛋白質(zhì)之間重新聚集，粒徑變大，導(dǎo)致其表觀黏度較HPH處理5 次相比有所增加。

圖6 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液流變特性的影響Fig. 6 Effect of HPH cycle on flowability of MPs in water

2.6 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液形貌結(jié)構(gòu)的影響

圖7 HPH處理MP水溶液的AFM圖Fig. 7 Effect of HPH cycle on AFM morphology of MPs in water

通過(guò)AFM觀察到了不同HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液形貌結(jié)構(gòu)的影響，如圖7所示，未經(jīng)處理的樣品中觀察到一束具有完整線性特征結(jié)構(gòu)的蛋白分子，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)還保持著高度有序的狀態(tài)，這與Yoshikawa等[27]在兔骨骼肌蛋白質(zhì)中觀察到的現(xiàn)象一致。經(jīng)過(guò)HPH處理之后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，表現(xiàn)出具有較小粒徑的分散顆粒，同時(shí)其顆粒高度也由91.6 nm降低到11.2 nm以下。隨著處理次數(shù)的增加，MP結(jié)構(gòu)顯示出更短更細(xì)的絲狀片段，并且釋放出一些單體或低聚體蛋白，當(dāng)處理次數(shù)達(dá)到3～4 次時(shí)，絲狀結(jié)構(gòu)會(huì)進(jìn)一步分裂破碎成具有亞單位的細(xì)絲或者單體蛋白[11]，顯著增加MP水溶液的分散性。當(dāng)處理次數(shù)達(dá)4 次以上時(shí)，如圖7E～G所示，由于處理次數(shù)過(guò)多，蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的相互作用，形成了一些較大顆粒的不規(guī)則聚集物[11]，同時(shí)觀察到樣品的顆粒高度在處理6 次時(shí)明顯增加。

2.7 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液表面疏水性的影響

圖8 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液表面疏水性的影響Fig. 8 Effect of HPH cycle on surface hydrophobicity of MPs in water

表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)的數(shù)量，它決定蛋白質(zhì)分子間相互作用的能力，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、功能性質(zhì)及構(gòu)象具有重要的作用。如圖8所示，未經(jīng)HPH處理樣品的疏水基團(tuán)大多數(shù)緊密包埋在球狀區(qū)域內(nèi)，疏水基團(tuán)與ANS之間的接觸受到抑制[28]，導(dǎo)致其具有較少的疏水基團(tuán)。經(jīng)HPH處理后，MP水溶液的表面疏水基團(tuán)數(shù)量均明顯增加，并且隨著HPH處理次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，其中經(jīng)過(guò)4 次HPH處理的樣品表面疏水性最高。HPH處理時(shí)，最初產(chǎn)生的高靜壓通過(guò)氫鍵和疏水作用導(dǎo)致水穿透蛋白質(zhì)的內(nèi)部從而修飾蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而破壞MP的三級(jí)結(jié)構(gòu)[25,29]。隨著HPH處理次數(shù)的增加，MP持續(xù)受到高靜壓、剪切力和空穴作用等機(jī)械力反復(fù)作用，蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊現(xiàn)象，抑制了部分二硫鍵的產(chǎn)生，促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露并且相互作用，從而導(dǎo)致表面疏水性持續(xù)提高。當(dāng)HPH處理次數(shù)達(dá)到4 次以上時(shí)，可以看到表面疏水性出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這可能是因?yàn)镸P蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開(kāi)的同時(shí)，眾多蛋白質(zhì)分子在疏水作用與二硫鍵作用下重新聚集[30]，導(dǎo)致疏水基團(tuán)減少，從而降低其表面疏水性。

2.8 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液活性巰基含量的影響

圖9 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液活性巰基含量的影響Fig. 9 Effect of HPH cycle on reactive sulfhydryl group content of MPs in water

巰基是MP中重要的功能基團(tuán)，其含量變化可以反映出MP空間結(jié)構(gòu)的改變。MP水溶液的活性巰基含量變化如圖9所示。經(jīng)過(guò)HPH處理后，與未經(jīng)處理的樣品（4.53 μmol/100 mg）相比，樣品的活性巰基含量顯著上升（P＜0.05），說(shuō)明HPH會(huì)導(dǎo)致MP中的巰基暴露在蛋白質(zhì)表面，這與Liu Wei等[31]的研究結(jié)果一致?；钚詭€基含量的增加說(shuō)明HPH可以誘導(dǎo)水中MP結(jié)構(gòu)展開(kāi)，有研究表明，HPH處理時(shí)產(chǎn)生的劇烈機(jī)械作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變或者變性[32]。當(dāng)MP懸濁液高速通過(guò)HPH均質(zhì)閥門(mén)時(shí)，會(huì)受到強(qiáng)剪切力、湍流和空穴作用等作用力，從而引起膠體顆粒和蛋白質(zhì)的分離、聚集或重排[12]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性、結(jié)構(gòu)展開(kāi)。蛋白質(zhì)分子展開(kāi)后可能會(huì)誘導(dǎo)巰基以及疏水基團(tuán)從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部暴露出來(lái)，導(dǎo)致其活性巰基含量增加。隨著HPH處理次數(shù)的增加，MP水溶液的活性巰基含量也持續(xù)增加，說(shuō)明多次的HPH處理可以顯著提升MP水溶液的活性巰基含量。同時(shí)，當(dāng)HPH處理次數(shù)為3～5 次時(shí)，活性巰基含量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），然而在HPH處理6 次時(shí)出現(xiàn)了顯著下降?？赡苁怯捎诋?dāng)HPH處理達(dá)到一定次數(shù)后，在強(qiáng)力的機(jī)械作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集現(xiàn)象，聚集體進(jìn)一步解折疊，導(dǎo)致暴露的巰基被氧化而重新形成二硫鍵，從而降低活性巰基含量[30]。

2.9 HPH處理次數(shù)對(duì)MP水溶液二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的影響

表1 CD分析MP水溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure composition of MPs in water determined by CD

如表1所示，與未經(jīng)HPH處理的樣品相比，所有經(jīng)過(guò)HPH處理后的MP水溶液表現(xiàn)出α-螺旋相對(duì)含量降低、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量增加的現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，熱加工和HPH處理會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，且后者對(duì)結(jié)構(gòu)改變起主導(dǎo)作用[30]，這可能是導(dǎo)致MP水溶液中α-螺旋相對(duì)含量降低的原因，肌球蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)的缺失可能導(dǎo)致分子間相互作用的變化，從而破壞蛋白組裝過(guò)程，導(dǎo)致在水中溶解度增加[24]。當(dāng)HPH處理次數(shù)為1～4 次時(shí)，隨著處理次數(shù)的增加，α-螺旋相對(duì)含量持續(xù)降低，說(shuō)明HPH持續(xù)對(duì)MP水溶液產(chǎn)生的機(jī)械作用可以誘導(dǎo)MP結(jié)構(gòu)的不斷展開(kāi)，同時(shí)β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的持續(xù)增加也說(shuō)明了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了展開(kāi)和重組[17]。當(dāng)HPH處理次數(shù)達(dá)到4 次以上時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)α-螺旋相對(duì)含量有增加趨勢(shì)；同時(shí)反向平行的β-折疊的結(jié)構(gòu)容易在聚集的蛋白分子中形成，說(shuō)明蛋白質(zhì)發(fā)生了不溶性的聚集，這與2.6節(jié)討論結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同次數(shù)的HPH處理對(duì)MP水溶液功能特性的影響進(jìn)行了研究，不同次數(shù)的HPH處理對(duì)MP水溶液結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)具有不同的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)4 次HPH處理的MP水溶液具有較好的溶解性（90%以上），同時(shí)HPH處理4～6 次的樣品在4 ℃下放置9 d后仍具有較好的穩(wěn)定性；SDS-PAGE結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)HPH處理后幾乎沒(méi)有發(fā)生蛋白質(zhì)降解的現(xiàn)象。隨著HPH處理次數(shù)的增加，MP水溶液的結(jié)構(gòu)被破壞，粒徑先減小后增大，同時(shí)表觀黏度降低，流動(dòng)能力得到改善；表面疏水性和活性巰基含量先增加后減少，α-螺旋相對(duì)含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量明顯變化；過(guò)多次數(shù)（4 次以上）的HPH處理會(huì)引起MP水溶液產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象，從而導(dǎo)致其溶解性以及穩(wěn)定性的下降。上述研究表明，不同次數(shù)HPH處理可以對(duì)MP水溶液的功能特性進(jìn)行調(diào)控。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)4 次HPH處理的MP水溶液具有較好的理化特性。選擇合適的HPH處理次數(shù)可以使MP水溶液具有較好的溶解性和穩(wěn)定性，降低粒徑、獲得較好的流動(dòng)性，從而達(dá)到改善其加工特性的目的，為其今后在食品工業(yè)中的加工應(yīng)用提供指導(dǎo)思路。