高強(qiáng)度間歇性訓(xùn)練與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

閆海龍 陳樂(lè)琴 張一民 蘇浩 汪贊

摘?要：目的：探討高強(qiáng)度間歇性訓(xùn)練（HIIT）與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)對(duì)肝細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響與差異，為運(yùn)動(dòng)防治急慢性肝病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：9月齡雄性wistar大鼠70只，隨機(jī)分為基礎(chǔ)值組（B，10只），4周安靜對(duì)照組（Q1，10只），4周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（M1，10只），4周HIIT組（H1，10只）和8周安靜對(duì)照組（Q2，10只），8周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（M2，10只），8周HIIT組（H2，10只）。安靜對(duì)照組大鼠不運(yùn)動(dòng)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組以60%VO2max強(qiáng)度進(jìn)行持續(xù)訓(xùn)練，HIIT組以50%VO2max、60%VO2max、80%VO2max的強(qiáng)度交替訓(xùn)練。跑臺(tái)訓(xùn)練每天50 min，每周5 d?；A(chǔ)值組大鼠在首次最大攝氧量測(cè)試后24～48 h取材，安靜對(duì)照組與干預(yù)組大鼠在干預(yù)后第4、8周最大攝氧量測(cè)試結(jié)束后24～48 h取材。采用HE染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)，采用Western Blot檢測(cè)肝細(xì)胞中LC3-Ⅱ、p62、Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：1）不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)組之間細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別，8周各組相比4周各組細(xì)胞間隙略有增大。2）與同周安靜對(duì)照組相比，8周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠肝細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）。而8周HIIT組上調(diào)LC3-Ⅱ、下調(diào)p62蛋白表達(dá)的效果更顯著（P<0.01）。3）與同周安靜對(duì)照組相比，中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)組在4周與8周均顯著下調(diào)Bax/Bcl-2（P<0.01），Caspase3蛋白表達(dá)在8周時(shí)顯著下調(diào)（P<0.01）。而HIIT在4周時(shí)下調(diào)Bax/Bcl-2比中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)更為顯著，但到8周時(shí)Bax/Bcl-2比率卻回升到與安靜組無(wú)顯著差異（P>0.05），對(duì)Caspase3蛋白表達(dá)也表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，4周時(shí)顯著下調(diào)（P<0.01），8周時(shí)與安靜組無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)論：1）8周HIIT可有效上調(diào)大鼠肝細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，下調(diào)p62蛋白表達(dá)，提高肝細(xì)胞自噬水平，相對(duì)于傳統(tǒng)的中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)更為有效;2）8周中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)可有效下調(diào)大鼠肝細(xì)胞Caspase3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2比值，降低肝細(xì)胞凋亡水平，相對(duì)于HIIT更為持續(xù)有效。

關(guān)鍵詞：高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（HIIT）;LC3-Ⅱ;p62;Bcl-2;Bax;Caspase3

中圖分類號(hào)：G804.2?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-2076（2019）03-0071-07

肝臟是人體內(nèi)最大的腺體，也是功能最復(fù)雜的器官之一，因?yàn)樗鼘?duì)解毒、合成和釋放生物分子以及對(duì)運(yùn)動(dòng)肌肉的能量供應(yīng)有主要作用。最近，肝臟也被證明在運(yùn)動(dòng)中對(duì)氧化還原狀態(tài)和炎癥調(diào)節(jié)起著重要的作用[1]。肝臟經(jīng)常受到一系列有害刺激的影響而導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡，在持續(xù)的破壞積累下，細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致炎癥、纖維化、肝硬化，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌[2-3]。導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡主要是由細(xì)胞凋亡和壞死引起的，也會(huì)因自噬等某些復(fù)雜情況引起[3-4]。

細(xì)胞自噬和凋亡是維護(hù)細(xì)胞和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的兩種重要的分解代謝過(guò)程[5]。各類研究已經(jīng)證實(shí)，它們?cè)跊Q定細(xì)胞命運(yùn)方面有著緊密且復(fù)雜的聯(lián)系。自噬可以通過(guò)提高半胱天冬蛋白酶（Caspase）活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡，也可以作為一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)，延遲Caspase酶的激活使細(xì)胞存活，并移除受損的細(xì)胞器[6]。凋亡抑制蛋白Bcl-2與Bcl-xL又可以與自噬因子Beclin-1相互作用抑制自噬[7]。新的證據(jù)表明，這兩種途徑中核心蛋白之間的相互作用是細(xì)胞凋亡與自噬之間關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制基礎(chǔ)[8]。時(shí)至今日，自噬已經(jīng)成為繼凋亡之后生命科學(xué)領(lǐng)域最熱門的研究之一，通過(guò)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平越來(lái)越成為人們研究的靶點(diǎn)，而目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)肝細(xì)胞自噬的影響研究尚少，細(xì)胞凋亡與自噬之間的調(diào)控機(jī)制也未完全明確。

高強(qiáng)度間歇性訓(xùn)練（High intensity interval training，HIIT）是一種以超過(guò)無(wú)氧閾強(qiáng)度或是接近于或大于最大攝氧量強(qiáng)度進(jìn)行重復(fù)多次的相對(duì)較短時(shí)間（如10 s～5 min）運(yùn)動(dòng)的方式。研究表明，它可以有效調(diào)節(jié)血糖水平[9]，提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低氧化應(yīng)激水平[10]。與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)相比，HIIT在預(yù)防和減少肝脂肪沉積、減輕脂肪組織炎癥和改善胰島素敏感性方面更有效[9，11]。眾多研究已經(jīng)顯示，細(xì)胞凋亡與自噬是運(yùn)動(dòng)鍛煉促進(jìn)機(jī)體健康的重要生理機(jī)制。本研究通過(guò)選取傳統(tǒng)的中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)與目前備受關(guān)注的高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練兩種干預(yù)方式，來(lái)探討它們對(duì)肝細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響與差異，為運(yùn)動(dòng)防治急慢性肝病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?對(duì)象與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

本研究選取9月齡清潔級(jí)雄性wistar大鼠70只。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為基礎(chǔ)值組（B，10只），4周安靜對(duì)照組（Q1，10只），4周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（M1，10只），4周HIIT組（H1，10只）和8周安靜對(duì)照組（Q2，10只），8周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（M2，10只），8周HIIT組（H2，10只）。所有大鼠均在清潔級(jí)環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由采食與飲水，動(dòng)物房溫度為25℃，12小時(shí)明暗周期交替。

1.2?實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案

安靜對(duì)照組：不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。

中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組：大鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)前先進(jìn)行VO2max測(cè)試。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，確定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60%VO2max強(qiáng)度[12]進(jìn)行訓(xùn)練，每天50 min，每周5 d。

HIIT運(yùn)動(dòng)組：運(yùn)動(dòng)干預(yù)前根據(jù)大鼠最大攝氧量測(cè)試結(jié)果，根據(jù)大鼠達(dá)到最大攝氧量時(shí)的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)速度，參考梁春瑜等[13]方案設(shè)計(jì)，確定HIIT運(yùn)動(dòng)方案進(jìn)行為期8周的訓(xùn)練，每天訓(xùn)練50 min，每周訓(xùn)練5 d，運(yùn)動(dòng)方案見(jiàn)表1。干預(yù)組大鼠每?jī)芍苓M(jìn)行一次最大攝氧量測(cè)試，根據(jù)最大攝氧量測(cè)試結(jié)果重新調(diào)整運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。

1.3?VO2max測(cè)試方案

所有大鼠在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及訓(xùn)練至第2，4，6，8周末時(shí)均進(jìn)行VO2max測(cè)試。最大攝氧量測(cè)試根據(jù)Leandro 等[14]的研究進(jìn)行改良，具體測(cè)試方案見(jiàn)表2。大鼠達(dá)到最大攝氧量的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：1）大鼠在電刺激的情況下不能在跑臺(tái)上繼續(xù)跑。2）兩級(jí)之間的VO2max/一級(jí)速度之間相差小于5%。測(cè)試儀器為開(kāi)放環(huán)路量熱計(jì)（OxymaxDeluxe System，哥倫布儀器，美國(guó)）。

1.4?取材

基礎(chǔ)值組大鼠在首次最大攝氧量測(cè)試結(jié)束后24～48 h取材，安靜對(duì)照組與干預(yù)組大鼠在干預(yù)后第4，8周最大攝氧量測(cè)試結(jié)束后24～48 h進(jìn)行取材。2%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，迅速摘取肝臟稱重，切取肝臟右葉投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，用于western-blot測(cè)試。

1.5?肝組織學(xué)樣本制備

將大鼠肝組織石蠟切片依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、分化、反藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片，制成HE染色切片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察、采圖。

1.6?Western Blot 檢測(cè)

取肝臟100 mg加入1 mL含有蛋白酶抑制劑的裂解液中低溫勻漿，使細(xì)胞充分裂解后置于4℃離心機(jī)離心，12 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液。隨后用Thermo Fisher的BCA試劑盒測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液，配平上樣量，70℃水浴10 min使蛋白變性后分裝樣品。

加樣到預(yù)制膠（NuPAGE Novex 12%Bis-Tris Gel）置于電泳槽，加入5%體積的電泳緩沖液，120 V電泳90 min;轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris 3.03 g/L、甘氨酸14.41 g/L、甲醇200 ml/L、蒸餾水）約90 min;5%脫脂奶粉封閉1 h;一抗（Abcam：GAPDH—Ab181602，P62—Ab109012，Bax—Ab32503;Cell Signaling： Caspase3—9664s;Santa Cruz：Bcl-2—Sc-7382;Nuvos：LC3—NB100-2220）封閉4℃搖床過(guò)夜，次日用TBST洗膜8 min×4;二抗（Abcam：GAPDH、P62、Bax、Caspase3—羊抗兔Ab6721;Thermo：Bcl-2—羊抗鼠A16078）封閉1 h，后用TBST 洗膜8 min×4;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-rad公司，美國(guó)）曝光顯影。

1.7?數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)試條帶采用Image Lab 4.0進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[AKX-]±SD）表示，運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異性分析。以P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為非常顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2?結(jié)果

2.1?肝組織形態(tài)

圖1顯示，不論是基礎(chǔ)值組還是安靜組與運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核大且呈圓形。不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)組之間細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別。8周各組相比4周各組細(xì)胞間隙略有增大，但細(xì)胞輪廓清晰，排列整齊，表明8周的HIIT與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)并未對(duì)肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)造成明顯影響，運(yùn)動(dòng)干預(yù)沒(méi)有過(guò)量。

2.2?各組大鼠肝細(xì)胞自噬因子LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)結(jié)果

圖2顯示，安靜組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（P>0.05）。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)總體呈上升趨勢(shì)，但到8周時(shí)才出現(xiàn)顯著性差異，此時(shí)M2組比Q2組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上升34.8%（P<0.05）。HIIT組與同周安靜組相比，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)在4周時(shí)略有下降但無(wú)顯著性差異（P>0.05），8周時(shí)卻顯著上升，此時(shí)H2組比Q2組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上升52.7%（P<0.01）。H2組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)高于M2組，但無(wú)顯著性差異（P>0.05），H2組比H1組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上升53.9%（P<0.01）。

這表明8周HIIT與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以顯著上調(diào)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，且HIIT的干預(yù)效果要優(yōu)于中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)。

圖3顯示，安靜組p62蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（P>0.05）。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組p62蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，M1組、M2組與同周安靜組相比p62蛋白表達(dá)分別顯著下降19.9%、21.1%（P<0.05）。HIIT組與同周安靜組相比，p62蛋白表達(dá)4周時(shí)無(wú)顯著差異（P>0.05），8周時(shí)H2比Q2顯著下降32.2%（P<0.01）。同時(shí)H2組比H1組p62蛋白表達(dá)顯著下降31.7%（P<0.01）。

這表明8周HIIT與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以顯著下調(diào)p62蛋白表達(dá)，且HIIT的干預(yù)效果要優(yōu)于中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)，但中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)的下調(diào)效果在4周時(shí)就表現(xiàn)出顯著性。

2.3?各組大鼠肝細(xì)胞凋亡因子Caspase3 、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

圖4顯示，安靜組Caspase3蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（P>0.05）。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組Caspase3蛋白表達(dá)總體呈下降趨勢(shì)，但到8周時(shí)才出現(xiàn)顯著性差異，此時(shí)M2組比Q2組Caspase3蛋白表達(dá)顯著下降38.4%（P<0.01）。HIIT組Caspase3蛋白表達(dá)先下降后上升，與同周安靜組相比，H1顯著下降36.6%（P<0.01），H2組已基本上升到比Q2組略低水平（P>0.05），H2比H1組顯著上升61.8%（P<0.01）。H1組比M1組顯著下降36.6%（P<0.01）。

這表明HIIT對(duì)Caspase3蛋白表達(dá)的下調(diào)效果主要在4周時(shí)，而中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)對(duì)Caspase3蛋白表達(dá)的下調(diào)效果主要在8周時(shí)。

圖5顯示，在Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果中，安靜組無(wú)顯著變化（P>0.05）。4周時(shí)與Q1組相比，M1組顯著上升22%（P<0.05），H1組顯著上升45%（P<0.01），H1組顯著高于M1組（P<0.01）。8周時(shí)與Q2組相比，H2組顯著下降15.2%（P<0.05），H2組相比H1組顯著下降38.2%（P<0.01）。

在Bax蛋白表達(dá)結(jié)果中，安靜組無(wú)顯著變化（P>0.05）。4周時(shí)與Q1組相比，M1組顯著下降16.5%（P<0.05），H1組顯著下降28%（P<0.01）。8周時(shí)與Q2組相比，M2組與H2組均無(wú)顯著性變化。

在Bax/Bcl-2比值結(jié)果中，安靜組無(wú)顯著變化（P>0.05）。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)M1組、M2組與同周安靜組相比分別顯著下降28.7%、26.7%（P<0.01）。HIIT組Bax/Bcl-2比值先下降后上升，與同周安靜組相比，H1顯著下降51.4%（P<0.01），H2組已上升到比Q2組略高但無(wú)顯著性（P>0.05），且H2組比H1組顯著上升1.17倍，同時(shí)H2組顯著高于M2組（P<0.01）。

這表明在對(duì)Bax與Bcl-2調(diào)控下的凋亡水平干預(yù)中，中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)在4周和8周都顯著下調(diào)了凋亡水平。而HIIT主要在4周時(shí)下調(diào)凋亡水平，且4周的干預(yù)效果優(yōu)于中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)。

[TP3q20.TIF，BP#][TS（][HT5"K][JZ]圖5?各組大鼠肝細(xì)胞免疫印跡Bax/Bcl-2結(jié)果比較[TS）]

3?討論

3.1?不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠肝細(xì)胞自噬因子LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)影響

自噬（autophagy）是真核細(xì)胞中高度保守且普遍存在的生命現(xiàn)象，主要用于降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)不被需要的生物大分子、受損傷的細(xì)胞器等[15]。自噬過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞內(nèi)需要降解的內(nèi)源性物質(zhì)形成自噬體（autophagosome）。與此同時(shí)，一種微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的胞漿形式LC3-Ⅰ與和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine， PE）偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，并穩(wěn)定定位于自噬體內(nèi)外膜表面。因此，LC3-Ⅱ被認(rèn)為自噬活動(dòng)的特異性標(biāo)志物。通常用LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值來(lái)衡量自噬活性[16]。但是由于LC3-Ⅱ?qū)贵w的敏感性高于LC3-Ⅰ，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果LC3-Ⅰ的減少并不與LC3-Ⅱ的增加同步，因此單純比較LC3-Ⅱ蛋白的水平可能更合適[17]。p62是SQSTM1編碼的泛素結(jié)合蛋白，是自噬的選擇性底物之一。當(dāng)自噬被激活時(shí)，p62 可連接LC3和泛素化的底物運(yùn)送至自噬體，在自噬體與溶酶體結(jié)合成的自噬溶酶體（autolysosome）中被一同降解。因此，對(duì)LC3與p62的免疫分析被用于監(jiān)測(cè)自噬流（autophagic flux）的變化[18]。

趙軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)高脂喂養(yǎng)的大鼠進(jìn)行23周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，可以顯著提高肝細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平，抑制ROS的生成，而高脂安靜組大鼠ROS生成增多，氧化應(yīng)激水平提高，發(fā)生肝炎和肝纖維化。Rosa[20]等也通過(guò)對(duì)高脂喂養(yǎng)與常規(guī)喂養(yǎng)的老鼠進(jìn)行4周自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)不管是高脂喂養(yǎng)還是常規(guī)喂養(yǎng)的老鼠均提高了肝臟基礎(chǔ)自噬水平，且相同喂養(yǎng)方式的運(yùn)動(dòng)組與安靜組相比，肝細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均顯著上升，p62蛋白表達(dá)均顯著下降。提示長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)提高肝細(xì)胞自噬水平，減少受損細(xì)胞器的積累，滿足能量供應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激，從而減少肝脂質(zhì)沉積和肝內(nèi)炎癥，阻止肝纖維化的發(fā)生，保護(hù)肝臟健康。本研究結(jié)果顯示，8周HIIT與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)均可顯著上調(diào)肝細(xì)胞自中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)p62蛋白表達(dá)。但8周時(shí)HIIT相比中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)上調(diào)LC3-Ⅱ、下調(diào)p62蛋白表達(dá)的效果更顯著。Wang Ningning[11]等研究也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于傳統(tǒng)中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)，8周的HIIT對(duì)于阻止肝脂肪沉積和調(diào)節(jié)代謝功能方面更為有效。推測(cè)長(zhǎng)期的HIIT對(duì)肝細(xì)胞自噬因子LC3-Ⅱ與p62蛋白表達(dá)的影響更大。值得注意的是，4周時(shí)HIIT組的LC3-Ⅱ與p62蛋白表達(dá)基本與安靜組一致，而中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)已有少量上升，p62蛋白表達(dá)更是已出現(xiàn)顯著下降，提示中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)對(duì)肝細(xì)胞LC3-Ⅱ與p62蛋白表達(dá)的影響早于HIIT。

3.2?不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達(dá)影響

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的細(xì)胞自主性死亡的過(guò)程，在眾多調(diào)控凋亡的因子中Bcl-2家族和Caspase家族發(fā)揮著重要作用。B細(xì)胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）是凋亡抑制基因，Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）是促進(jìn)凋亡的基因，Bax/Bcl-2的比率形成了細(xì)胞凋亡的“分子開(kāi)關(guān)”，Bax/Bcl-2升高細(xì)胞趨于凋亡，反之細(xì)胞凋亡受到抑制。而凋亡的細(xì)胞死亡最終由Caspase家族完成。半胱天冬蛋白酶-3（Caspase3）處于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心位置，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，當(dāng)它被上游信號(hào)激活后，會(huì)自身切割為有活性的狀態(tài)，并水解下游底物，切斷DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。一旦Caspase3被激活，細(xì)胞死亡將不可被逆轉(zhuǎn)[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，在游泳至力竭后的老鼠海馬體中即刻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著增多，凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，Caspase3蛋白表達(dá)顯著增加，說(shuō)明力竭運(yùn)動(dòng)后細(xì)胞內(nèi)Ca2+的超載是引發(fā)凋亡增多的原因之一[23]。對(duì)大鼠進(jìn)行5周游泳運(yùn)動(dòng)后，急性力竭運(yùn)動(dòng)組心肌組織的SIRT1和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，Bax和心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，急性力竭加耐力訓(xùn)練組Bax和心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，急性力竭加耐力訓(xùn)練加SIRT1抑制組SIRT1和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯更低，Bax和細(xì)胞凋亡明顯更高[24]，表明SIRT1信號(hào)通路的激活和耐力運(yùn)動(dòng)可以抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。人體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)[25]，在短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，周圍血液中白細(xì)胞的MTP立即下降，白細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中和運(yùn)動(dòng)后逐漸趨于凋亡，同時(shí)在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，腫瘤壞死因子和可溶性Fas配體的血漿濃度升高，表明短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致外周血白細(xì)胞凋亡的增加和促炎癥介質(zhì)的增加。金其貫[26-27]等研究認(rèn)為，適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使大鼠骨骼肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)增加，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使骨骼肌細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)下降。以上研究表明：運(yùn)動(dòng)形式、運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡會(huì)產(chǎn)生不同影響，短時(shí)間大強(qiáng)度或力竭運(yùn)動(dòng)會(huì)使促凋亡蛋白表達(dá)升高，抗凋亡蛋白表達(dá)降低;而長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)才能有效抑制細(xì)胞的凋亡，保護(hù)機(jī)體免受外界刺激誘發(fā)的細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中，中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)在4周與8周均顯著下調(diào)Bax/Bcl-2比值，對(duì)Caspase3蛋白表達(dá)主要在8周時(shí)顯著下調(diào)。Luo[28]等實(shí)驗(yàn)也表明，6周的耐力訓(xùn)練能明顯減少肝細(xì)胞凋亡數(shù)目。而HIIT在4周時(shí)下調(diào)Bax/Bcl-2比中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)更為顯著，但到8周時(shí)Bax/Bcl-2比率卻回升到與安靜組無(wú)顯著差異，對(duì)Caspase3的蛋白表達(dá)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，4周時(shí)顯著下調(diào)，8周時(shí)與安靜組無(wú)顯著差異，表明HIIT對(duì)Bax/Bcl-2與Caspase3蛋白表達(dá)主要在4周時(shí)下調(diào)，而中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)在這方面表現(xiàn)得更為持久。

3.3?肝細(xì)胞自噬與凋亡關(guān)系的探討

大量研究表明，細(xì)胞自噬和凋亡廣泛存在于真核細(xì)胞生物體內(nèi)，是維護(hù)細(xì)胞和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的兩種重要分解代謝過(guò)程[5]。盡管凋亡與自噬的特征及機(jī)制不同，但兩種途徑并不是相互獨(dú)立的，它們有共同的刺激因子和調(diào)節(jié)蛋白，兩種途徑之間存在著復(fù)雜的對(duì)話。根據(jù)二者調(diào)控方式的不同，可大致將其交互作用歸納為兩種：合作關(guān)系和拮抗關(guān)系。自噬與凋亡表現(xiàn)為合作關(guān)系在現(xiàn)有研究中較為多見(jiàn)。該種情況下，自噬與凋亡的調(diào)控目標(biāo)都是促進(jìn)細(xì)胞死亡?；蚋髯酝揭l(fā)細(xì)胞死亡，或—種為主，另一為輔，也可在—方功能缺陷的情況下，另一方替補(bǔ)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。很多誘導(dǎo)凋亡的刺激常常也會(huì)誘導(dǎo)自噬，例如在治療肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以同時(shí)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和自噬來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖[29]。研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧可以通過(guò)激活活性氧同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬增加，從而抑制胎盤的發(fā)育[30]。拮抗關(guān)系中，自噬與凋亡相互抑制，細(xì)胞自噬的上調(diào)抑制凋亡的發(fā)展，促使細(xì)胞存活。例如在骨質(zhì)疏松癥的病理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞自噬可有效抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶標(biāo)[31]。在老鼠的癌癥模型中發(fā)現(xiàn)，自噬通過(guò)抑制p53的反應(yīng)來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，維持線粒體功能，在壓力下維持代謝平衡和生存，防止癌細(xì)胞凋亡[32]。張昊[33]等也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過(guò)上調(diào)的自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1、LC3的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善老齡大鼠心臟功能。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)肝細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè)顯示，8周中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)可以持續(xù)上調(diào)肝細(xì)胞自噬水平，下調(diào)肝細(xì)胞凋亡水平。而HIIT對(duì)肝細(xì)胞的影響整體上也表現(xiàn)出上調(diào)自噬水平與下調(diào)凋亡水平的情況，但與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)相比，HIIT在4周時(shí)主要表現(xiàn)在下調(diào)肝細(xì)胞凋亡水平，且比中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)下調(diào)凋亡的程度大，而在8周時(shí)HIIT主要表現(xiàn)在上調(diào)肝細(xì)胞自噬水平，且比中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)上調(diào)自噬的程度大。表明與中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)相比，HIIT對(duì)肝細(xì)胞自噬與凋亡水平的影響起效更快，刺激程度更大，但影響效果并不持久。在兩種不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肝細(xì)胞的影響中，肝細(xì)胞自噬與凋亡表現(xiàn)出相互拮抗的關(guān)系，肝細(xì)胞自噬水平的上調(diào)會(huì)抑制肝細(xì)胞凋亡，改善和保護(hù)大鼠肝臟功能。

4?結(jié)論

4.1?8周HIIT可有效上調(diào)大鼠肝細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，下調(diào)p62蛋白表達(dá)，提高肝細(xì)胞自噬水平，相對(duì)于傳統(tǒng)的中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)更為有效。

4.2?8周中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)可有效下調(diào)大鼠肝細(xì)胞Caspase3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2比值，降低肝細(xì)胞凋亡水平，相對(duì)于HIIT更為持續(xù)有效。

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