利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析茄子萼片刺相關(guān)差異基因

潛宗偉，陳海麗，崔彥玲

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心,農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

植物的刺是植物表皮上的表皮毛，表皮毛(Trichomes)是許多植物表面著生的附屬物，由表皮細(xì)胞發(fā)育形成。表皮毛分為單細(xì)胞或多細(xì)胞，有腺體或無(wú)腺體。植物表皮毛具有一系列重要的功能：一般有腺體的表皮毛可以分泌一些次生代謝物質(zhì)來(lái)抵抗病蟲(chóng)害，同時(shí)也能吸引動(dòng)物或堆積鹽分；無(wú)腺體的表皮毛一般具有散熱、增強(qiáng)對(duì)逆境的抗性的作用[1]。關(guān)于植物表皮毛的研究主要集中在模式植物擬南芥上，目前，擬南芥表皮毛的形成已經(jīng)成為研究植物細(xì)胞形態(tài)建成的模式系統(tǒng)。擬南芥的表皮細(xì)胞的發(fā)育涉及一個(gè)正調(diào)控和一個(gè)負(fù)調(diào)控，其中正調(diào)控是由3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(GL1、TTG1、GL3)組成的復(fù)合物來(lái)完成的，負(fù)調(diào)控是由一個(gè)抑制因子來(lái)完成的[2-3]。在蔬菜作物中，對(duì)黃瓜的刺瘤等表皮毛研究較為深入，與黃瓜果皮刺瘤相關(guān)的基因共有10個(gè)，主要包括果實(shí)黑刺基因(B)、無(wú)刺基因(gl)、多刺基因(ns)、果刺頻率基因(s)和小刺基因(ss)[4]。茄科植物番茄的表皮毛的形成機(jī)理較為復(fù)雜，目前控制番茄腺毛的Wo基因已經(jīng)被克隆出來(lái)，該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控B型細(xì)胞周期蛋白基因SlCycB2的表達(dá)來(lái)控制番茄型Ⅰ腺毛的形成[5]。hl基因?qū)е路阉蓄愋偷南倜で?，od-2基因?qū)е路癣裥秃虸V型腺毛呈圓柱狀，腺體消失，VI型腺毛密度降低，腺體變小[6-7]。

利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可以通過(guò)所有轉(zhuǎn)錄本的變化來(lái)揭示植物性狀、抗性等表型變化，是分析、定位植物表型、抗性等重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的重要手段之一。Guo等[8]通過(guò)比較栽培型和野生型西瓜的轉(zhuǎn)錄組差異，鑒定出了西瓜糖代謝、類胡蘿卜素合成及代謝、果肉品質(zhì)變化及乙烯合成等相關(guān)關(guān)鍵基因。Zhang等[9]通過(guò)比較抗根腫病甘藍(lán)野生種及感病青花菜的轉(zhuǎn)錄組差異，鑒定出了調(diào)控根腫病抗性的相關(guān)基因及代謝途徑。Wang等[10]通過(guò)比較耐熱和耐高溫不結(jié)球白菜的轉(zhuǎn)錄組差異，鑒定出了白菜耐熱相關(guān)表達(dá)基因。在茄子遺傳育種中，轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用也較為廣泛，魏明明等[11]利用茄子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)大量的可以應(yīng)用的SSR分子標(biāo)記。李笑[12]通過(guò)分析野生茄水茄接種黃萎菌后的轉(zhuǎn)錄組差異，篩選出一個(gè)與茄子黃萎病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因StWRKY-1。王世界[13]通過(guò)分析紫色茄皮和白色茄皮的轉(zhuǎn)錄組差異，篩選到與茄子花青素生物合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子3個(gè)和結(jié)構(gòu)基因8個(gè)。

本研究采用高通量測(cè)序方法，在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)茄子萼片有刺和無(wú)刺性狀的差異基因表達(dá)量進(jìn)行了分析。通過(guò)GO和KEGG富集和功能注釋，期望篩選到影響茄子萼片刺的有無(wú)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而明確茄子萼片刺有無(wú)的分子機(jī)制，為茄子萼片無(wú)刺品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心茄子課題組提供。自交系1607(紫黑長(zhǎng)茄、綠萼、萼片無(wú)刺)和1608(紫黑長(zhǎng)茄、綠萼、萼片有刺)均為純合的高代自交系。2015年冬在海南三亞以1607為母本，1608為父本獲得雜交組合，2016年春構(gòu)建F2群體，同年9月定植于北京海淀區(qū)四季青試驗(yàn)溫室。

1.2 田間表型調(diào)查及取樣

調(diào)查每株茄子門(mén)茄刺的有無(wú)，有刺記為1，無(wú)刺記為0，為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，分別在門(mén)茄蕾期、花期和果期進(jìn)行調(diào)查。選雙親，30株萼片有刺和30株萼片無(wú)刺植株，分別取植株上成熟茄子的萼片，提取RNA，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度和完整性等，不合格樣品重新取樣提取，取等量RNA分別構(gòu)建有刺和無(wú)刺RNA混池。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

樣品檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，分別使用Qubit 2.0和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大小(Insert Size)進(jìn)行檢測(cè)，使用Q-PCR 方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。用HiSeqX Series進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理 對(duì)測(cè)序獲得的Raw Data進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads，獲得高質(zhì)量的Clean Data。獲得Clean Reads后，將其與參考基因組(SolanummelongenaL.，ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Solanum_melongena/)進(jìn)行序列比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測(cè)序樣品特有的序列特征信息。

伴隨著重構(gòu)視圖的增加，通過(guò)計(jì)算得到的表示相機(jī)位姿信息的旋轉(zhuǎn)矩陣、位移向量和三維點(diǎn)云信息累積的誤差會(huì)越來(lái)越大，會(huì)導(dǎo)致重建結(jié)果與實(shí)際偏差較大，故引入非線性優(yōu)化算法光束平差法來(lái)優(yōu)化相機(jī)的內(nèi)外參數(shù)以及特征點(diǎn)的三維坐標(biāo)數(shù)據(jù)。算法使用最小二乘法減小圖像中觀測(cè)點(diǎn)像素坐標(biāo)與預(yù)測(cè)的像素坐標(biāo)之間的誤差，原型表示為式（14）

1.4.2 基因表達(dá)量分析 使用Cufflinks軟件計(jì)算每個(gè)基因的FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)[14]。利用EBSeq[15]進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得2個(gè)樣品之間的差異表達(dá)基因集。在差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中，以Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 差異基因Go分類和KEGG分析 利用Blast 2 Go程序獲得茄子每個(gè)基因的Go注釋。使用BlastP將差異基因序列比對(duì)到Swiss-Prot和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)，從而得到差異基因的Go功能注釋信息，利用WEGO在線軟件進(jìn)行Go分類和Go圖的制作[16]。使用BBH(bi-directional best hit)對(duì)差異基因的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝途徑進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

基于邊合成邊測(cè)序(Sequencing By Synthesis, SBS)技術(shù)，利用IlluminaHiSeq4000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)雙親、混池的4個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，共獲得60.77 Gb的Clean Data，各樣品Q30堿基百分比在88.9%以上(表1)。經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)處理，4個(gè)文庫(kù)共獲得409 363 358個(gè)Clean Reads，利用Bowtie 2軟件將Clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，共有311 756 616個(gè)比對(duì)到基因組，比對(duì)效率均大于75.00%。有刺混池和無(wú)刺混池分別有104 202 238個(gè)和109 191 303個(gè)Clean reads比對(duì)到參考基因組，其中比對(duì)到唯一的位置的Uniq Mapped Reads分別為72.93%和74.14%。以上比對(duì)結(jié)果表明，從建庫(kù)到測(cè)序等均達(dá)到試驗(yàn)要求。

對(duì)樣品的測(cè)序隨機(jī)性進(jìn)行了評(píng)估，分析測(cè)序數(shù)據(jù)在參考基因上的隨機(jī)分布情況。萼片有刺混池和無(wú)刺混池的隨機(jī)性圖呈均勻分布(圖1)，表明測(cè)序reads在參考基因上的分布相對(duì)較為均勻，測(cè)序隨機(jī)性較好。

表1 RNA-Seq數(shù)據(jù)的比對(duì)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Summary of RNA-Seq data

A.有刺混池; B.無(wú)刺混池。A.Bulk R; B.Bulk r.

2.2 新基因的發(fā)掘及功能注釋

基于茄子參考基因組的序列，使用Cufflinks軟件對(duì)Mapped Reads進(jìn)行拼接，并與原基因組注釋信息進(jìn)行比較，找出未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，獲得新的轉(zhuǎn)錄本和基因，并對(duì)其進(jìn)行注釋。過(guò)濾掉少于50個(gè)氨基酸殘基和只包含單個(gè)外顯子的序列，共發(fā)掘24 310個(gè)新基因。

對(duì)獲得的全部新基因與NR、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得新基因的注釋信息(表2)。獲得注釋信息的基因總數(shù)為1 540個(gè)，占新基因總數(shù)的6.33%，其中注釋到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的新基因數(shù)分別為771，550個(gè)。

表2 新基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary of new gene function annotation

2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)及Go和KEGG分析

2.3.1 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì) 雙親和2個(gè)混池通過(guò)差異基因表達(dá)分析，得到2 574個(gè)差異表達(dá)基因，其中共同含有的差異基因97個(gè)(圖2)。雙親間共有2 438個(gè)差異表達(dá)基因，其中839個(gè)基因在父本(萼片有刺)中的表達(dá)量顯著高于母本(萼片無(wú)刺)，1 599個(gè)基因在父本(萼片有刺)中的表達(dá)量顯著低于母本(萼片無(wú)刺)。有刺和無(wú)刺混池間共有233個(gè)差異表達(dá)基因，其中127個(gè)基因在萼片有刺混池中的表達(dá)量顯著高于無(wú)刺混池，106個(gè)基因在萼片有刺混池中的表達(dá)量顯著低于無(wú)刺混池。

2.3.2 差異表達(dá)基因Go分析 對(duì)雙親和有刺無(wú)刺2個(gè)混池的差異表達(dá)基因進(jìn)行了Go顯著性富集分析，明確其在各Go項(xiàng)中的分布情況(圖3)。Go注釋分析顯示在雙親和混池間分別有1 237，121個(gè)差異基因具有Go注釋信息。雙親和混池差異基因在分子功能和生物過(guò)程中富集的Go項(xiàng)是一致的，均為在分子功能中催化活性和結(jié)合亞類呈極顯著富集，生物過(guò)程中的代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和單一生物過(guò)程等3個(gè)亞類呈極顯著富集。雙親和混池在所處的細(xì)胞位置的富集有所差異，其中雙親分布最多的3個(gè)亞類分別為細(xì)胞、膜和細(xì)胞組分，混池分布最多的3個(gè)亞類分別為細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞組分。

同時(shí)對(duì)雙親和有刺無(wú)刺2個(gè)混池的共有的97個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行Go功能注釋，共計(jì)有50個(gè)基因具有Go注釋信息。其中在分子功能中催化活性和結(jié)合2個(gè)亞類極顯著富集，在生物過(guò)程中代謝過(guò)程，細(xì)胞過(guò)程和單一生物過(guò)程，生物調(diào)節(jié)和對(duì)刺激的反應(yīng)等5個(gè)亞類呈極顯著富集，細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞，細(xì)胞器和細(xì)胞組分極顯著富集。

在茄子雙親和混池的共有差異基因的Go富集分析結(jié)果表明，富集基因最多的為生物過(guò)程中的代謝過(guò)程，共包含35個(gè)基因，表明茄子萼片刺基因的有無(wú)可能與代謝物質(zhì)的合成與調(diào)節(jié)有關(guān)。

圖2 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.2 Summary of the differentially expressed genes

擬南芥中調(diào)控表皮毛的重要調(diào)控基因TTG1和GL3等都屬于生物過(guò)程中的重要基因，且在茄子雙親和混池的共有差異基因中富集基因最多的為生物過(guò)程。在生物過(guò)程中通過(guò)Go功能注釋篩選出茄子萼片刺合成相關(guān)的代謝過(guò)程：細(xì)胞分裂素分解代謝過(guò)程、細(xì)胞分裂素代謝過(guò)程、對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)、代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程等共篩選了7個(gè)基因(表3)。這7個(gè)代謝相關(guān)基因中有2個(gè)基因(Eggplant_newGene_1802、Sme2.5_09750.1_g00002)在雙親及混池間無(wú)刺相對(duì)于有刺是共同上調(diào)表達(dá)的，可能是參與了茄子萼片刺合成的關(guān)鍵基因。

2.3.3 差異表達(dá)基因KEGG分析 通過(guò)KEGG分析，分別對(duì)雙親和混池間的差異基因主要富集的代謝通路進(jìn)行了分析(圖4)。雙親中差異表達(dá)基因主要涉及的特異代謝通路為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原體相互作用和苯丙烷類生物合成。兩混池中差異表達(dá)基因主要涉及的特異代謝通路為角質(zhì)、小檗堿和蠟生物合成、淀粉和蔗糖代謝和戊糖和葡萄糖醛酸。對(duì)雙親和有刺無(wú)刺2個(gè)混池共有的97個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，共計(jì)有17個(gè)基因涉及26個(gè)代謝通路，代謝通路較為分散，沒(méi)有呈現(xiàn)顯著富集。

在KEGG富集分析中角質(zhì)、小檗堿和蠟生物合成代謝通路是形成植物角質(zhì)、蠟質(zhì)等表皮部分重要的途徑。茄子萼片刺為茄子表皮毛細(xì)胞的變異，為茄子表皮的重要組成部分，因此進(jìn)一步對(duì)角質(zhì)、小檗堿和蠟生物合成代謝通路進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(表4)。只有1個(gè)新基因Eggplant_newGene_4241在雙親和兩混池之間同時(shí)被富集到，并且無(wú)刺相對(duì)于有刺該基因顯著上調(diào)。有2個(gè)基因(Sme2.5_00096.1_g00020、Sme2.5_02057.1_g00007)僅在雙親間被富集到，有5個(gè)基因僅在兩混池間被富集到，但無(wú)刺相對(duì)于有刺這7個(gè)基因都顯著下調(diào)。

A，B圖分別為雙親和兩混池差異基因。A. The GO categories of the parents; B. The GO categories of the mixed pools.

基因名稱Genes name功能Function表達(dá)量(log2Fold-change value)P1 vs P2Bulk R vs Bulk rEggplant_newGene_1802細(xì)胞分裂素分解代謝過(guò)程1.551.42Sme2.5_00411.1_g00011細(xì)胞分裂素分解代謝過(guò)程-1.451.08Sme2.5_00083.1_g00005對(duì)生長(zhǎng)素反應(yīng)過(guò)程-7.291.62Sme2.5_33421.1_g00001代謝過(guò)程3.84-2.43Sme2.5_09750.1_g00002代謝過(guò)程1.221.37Sme2.5_00172.1_g00023代謝過(guò)程4.87-2.13Sme2.5_02682.1_g00003細(xì)胞過(guò)程6.35-2.87

A、B圖分別為雙親和兩混池中差異表達(dá)基因的KEGG分類圖。A.The KEGG pathway of the parents; B.The KEGG pathway of the mixed pools.

基因名稱Genes功能Function表達(dá)量(log2Fold-change value)P1 vs P2Bulk R vs Bulk rEggplant_newGene_4241脂肪?；o酶A還原酶1.641.11Sme2.5_00096.1_g00020脂肪酸ω-羥化酶-4.71無(wú)Sme2.5_02057.1_g00007脂肪酸ω-羥化酶-1.78無(wú)Sme2.5_00021.1_g00010長(zhǎng)鏈脂肪酸ω-單加氧酶無(wú)-2.46Sme2.5_02174.1_g00001脂肪酸ω-羥化酶無(wú)-2.46Sme2.5_02440.1_g00001ω-羥基棕櫚酸O-阿魏酰轉(zhuǎn)移酶無(wú)-2.36Sme2.5_03548.1_g00005脂肪?；o酶A還原酶無(wú)-1.88Sme2.5_11159.1_g00002醛脫羰酶無(wú)-3.34

2.4 相關(guān)候選基因Blast比對(duì)分析

將雙親和2個(gè)混池的差異基因通過(guò)Go和KEGG分析富集篩選的3個(gè)相關(guān)基因(Eggplant_newGene_1802、Sme2.5_09750.1_g00002、Eggplant_newGene_4241)和擬南芥、番茄的基因組進(jìn)行同源Blast比對(duì)分析(表5)。和番茄基因組(Tomato Genome CDS(ITAG release 3.20))比對(duì)，Eggplant_newGene_4241和Sme2.5_09750.1_g00002在番茄的同源基因分別為Solyc11g067180.2和Solyc01g079300.3，它們?cè)诜阎蟹謩e負(fù)責(zé)編碼脂肪?；o酶A還原酶和水蘇糖合成酶的合成，Eggplant_newGene_1802比對(duì)到2個(gè)同源基因，為Solyc04g080820.2和Solyc04g080810.3，它們?cè)诜阎蟹謩e負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞分裂素氧化酶和細(xì)胞分裂素氧化酶/類脫氫酶的合成。和擬南芥基因組比對(duì)，Eggplant_newGene_4241未能找到與擬南芥同源基因，Eggplant_newGene_1802在擬南芥的同源基因?yàn)锳T1G75450.1(AtCKX6)，它編碼催化類細(xì)胞分裂素降解的酶(細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶)，Sme2.5_09750.1_g00002在擬南芥的同源基因?yàn)锳T4G01970.1(AtRS4)，它編碼棉子糖和高親和力的水蘇糖合成酶以及水蘇糖和Gol特異性半乳糖水解酶(Sta和Gol特異性半乳糖水解酶)。

表5 相關(guān)基因同源比對(duì)分析Tab.5 The orthologous of the related genes

3 討論與結(jié)論

茄子萼片是茄子果實(shí)的重要組成部分，育種工作中比較關(guān)心的萼片相關(guān)性主要包括萼片的顏色、大小、刺[17]。茄子萼片刺是重要的品質(zhì)性狀，萼片刺的有無(wú)、數(shù)量、顏色和大小都是影響茄子商品性的重要因素。本研究以茄萼片刺的有無(wú)為研究目標(biāo)，利用轉(zhuǎn)錄組分析了影響萼片刺形成的調(diào)控因子。

3.1 茄子萼片刺與植物細(xì)胞分裂素分解代謝

細(xì)胞分裂素(Cytokinin, CK)是在植物體內(nèi)存在的重要植物激素，它主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂，對(duì)調(diào)節(jié)根、芽的分化，維管束的形成等植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用[18]。CK的合成和代謝是一個(gè)綜合調(diào)控的過(guò)程，它的合成主要是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)催化，天然異戊烯類CK及其核苷主要是以細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(Cytokinin oxidase/dehydrogenase, CKX, EC: 1.5.99.12)來(lái)催化發(fā)生不可逆降解[19]。CKX在植物體內(nèi)普遍存在，最早是由paces在煙草勻漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，之后相繼在擬南芥、水稻、大麥和小麥中被發(fā)現(xiàn)[20-22]。大多數(shù)植物含有多個(gè)CKX基因，擬南芥含有7個(gè)CKX基因(AtCKX1～AtCKX7)，其中AtCKX7與其他CKX基因差異較大[23]。水稻至少含有11個(gè)CKX基因(OsCKX1～OsCKX11)[24]，玉米至少含有13個(gè)CKX基因(ZmCKX1～ZmCKX13)[25]。

通過(guò)對(duì)差異基因的GO注釋分析，在雙親及混池中富集到了一個(gè)與茄子的細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶相關(guān)的基因：Eggplant_newGene_1802(SmCKX)，這個(gè)基因?yàn)榍炎愚D(zhuǎn)錄組獲得的新基因，該基因與番茄的Solyc04g080820.2和Solyc04g080810.3同源性較高，和擬南芥中的AtCKX6具有同源性。在擬南芥中，AtCKX6能夠顯著增強(qiáng)CKX活性，降低植物細(xì)胞分裂素濃度并引起表型的變化[23]。參考擬南芥同源基因，以上結(jié)果表明，SmCKX可能是茄子中存在的CKX基因，該基因可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂素的變化來(lái)控制茄子表型的變化。茄子萼片有刺該基因的表達(dá)量明顯減少，說(shuō)明SmCKX對(duì)茄子萼片的刺可能是一個(gè)負(fù)調(diào)控的過(guò)程，茄子萼片有刺的植株體內(nèi)細(xì)胞分裂素可能受到抑制。

3.2 茄子萼片刺與糖代謝過(guò)程

水蘇糖是在植物中普遍積累的一種棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharieds, RFOs)，RFOs在植物中的分布僅次于蔗糖，是植物韌皮部運(yùn)輸?shù)闹匾镔|(zhì)，對(duì)植物在逆境中的抗性、種子耐脫水性等具有重要的作用[26-27]。水蘇糖合成是很多酶參與的一個(gè)過(guò)程，水蘇糖合成酶(Stachyose synthase，STS, EC 2.4.1.67)是水蘇糖合成中最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶[28]。研究者先后從赤豆、豌豆、心葉假面花中克隆出了水蘇糖合成酶相關(guān)基因，并研究了其在植物中的調(diào)節(jié)的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程[29-30]。

參與茄子水蘇糖合成的相關(guān)基因及其調(diào)控過(guò)程是未知的。通過(guò)萼片有刺和無(wú)刺的雙親及混池差異基因的GO分析，富集到了一個(gè)與水蘇糖合成酶相關(guān)的基因：Sme2.5_09750.1_g00002(SmSTS)，該基因?qū)儆谔擒账饷讣易?Glycoside hydrolase, super family)，與番茄的Solyc01g079300.3基因和擬南芥的AT4G01970.1基因同源性較高。萼片無(wú)刺相對(duì)于有刺該基因顯著上調(diào)。表明茄子萼片刺的形成與茄子植物內(nèi)水蘇糖的合成有一定的關(guān)聯(lián)，茄子萼片刺的形成，茄子萼片上的水蘇糖的合成可能會(huì)受到抑制，是一個(gè)負(fù)調(diào)控的過(guò)程。植物表皮刺的形成與植物的抗蟲(chóng)性等防御機(jī)制有一定的關(guān)系，這和水蘇糖調(diào)節(jié)植物抗性有一定的類似作用。試驗(yàn)結(jié)果證明了2個(gè)途徑在茄子中可能存在關(guān)聯(lián)，但是如何通過(guò)茄子水蘇糖合成酶(SmRS)來(lái)調(diào)節(jié)兩者之間的關(guān)聯(lián)表達(dá)還需要進(jìn)一步研究。

3.3 茄子萼片刺與植物角質(zhì)，小檗堿和蠟生物合成途徑

陸地高等植物大部分的表皮細(xì)胞是由角質(zhì)膜覆蓋的，它從內(nèi)到外分成角化層、角質(zhì)層和蠟質(zhì)層3層，其中角質(zhì)層是角化膜最重要的部分，占整個(gè)角質(zhì)膜的50%以上，角質(zhì)層是植物適應(yīng)外界環(huán)境的重要物質(zhì)[31-32]。根據(jù)疏水層是否溶解于氯仿或正己烷等有機(jī)溶劑，可將植物角質(zhì)層分成角質(zhì)層蠟質(zhì)和角質(zhì)[33]。植物表皮的蠟質(zhì)直接與外界環(huán)境接觸，因此，其對(duì)植物蒸騰作用的調(diào)節(jié)、抗病、抗蟲(chóng)具有重要的意義[34-36]。表皮蠟質(zhì)的生物合成最先始于脂肪酸的從頭合成，它是細(xì)胞質(zhì)中的C16和C18的生物合成[37]。C16/C18再經(jīng)過(guò)酶的催化延長(zhǎng)，通過(guò)?；€原和脫羰基2個(gè)途徑合成蠟質(zhì)[38]。這2種途徑中脂肪酰輔酶A還原酶(Fatty acyl-CoA reductase, FAR)都是催化形成脂肪醛的關(guān)鍵還原酶[39]。植物中的脂肪酞輔酶A還原酶大約由490～500個(gè)氨基酸構(gòu)成，在擬南芥、水稻和小麥中均被克隆出來(lái)，其中擬南芥中含有3個(gè)類型的8個(gè)FAR基因[40]。

通過(guò)對(duì)差異基因的KEGG注釋分析，在茄子萼片有刺和無(wú)刺的雙親及混池中均富集到了一個(gè)脂肪酰輔酶A還原酶相關(guān)基因：Eggplant_newGene_4241(SmFAR)，該基因是一個(gè)新基因，與同屬茄科的番茄Solyc11g067180.2基因(FARx相關(guān)基因)同源性較高，但是在擬南芥中沒(méi)有找到相關(guān)同源基因。在番茄中，F(xiàn)ARx相關(guān)基因的增加能夠調(diào)控番茄表皮蠟質(zhì)晶體的合成，增加番茄的保水能力。參考番茄同源基因，茄子萼片刺的合成可能與表皮的蠟質(zhì)合成具有相同的合成代謝通路，需要通過(guò)脂肪酰輔酶A還原酶來(lái)調(diào)控，萼片有刺茄子可能通過(guò)該酶的下調(diào)，減少合成表面蠟質(zhì)來(lái)合成茄子萼片等部位的刺。