葛玉松

鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鹽城 224000

丁細(xì)牙痛膠囊處方由丁香葉和細(xì)辛組成，具有清熱解毒、疏風(fēng)止痛功能；用于治療風(fēng)火牙疼，急性牙髓炎、急性根尖炎等癥[1]。本方中丁香葉中所含原兒茶酸、原兒茶醛具有廣譜抗菌消炎作用[2]；細(xì)辛所含細(xì)辛脂素具有祛風(fēng)止痛功效，可用于治療牙痛[3]。因此可將細(xì)辛脂素、原兒茶酸、原兒茶醛作為本品含量測(cè)定指標(biāo)?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]采用供試品在酸性條件下與亞硝鈉-鉬酸鈉反應(yīng)，以原兒茶酸為對(duì)照，紫外分光光度法測(cè)定丁香葉內(nèi)的含量，此方法靈敏度及專屬性較差。本研究參照有關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丁細(xì)牙痛膠囊中細(xì)辛脂素、原兒茶醛、原兒茶酸的含量，以期更好地控制該品的質(zhì)量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀 （島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）；XS205DU電子天平 （梅特勒-特利多電子有限公司）；XP26電子天平 （瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500型超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丁細(xì)牙痛膠囊 （規(guī)格0.45 g，批號(hào)20170903、20180312、20180907，深圳市泰康制藥有限公司）；細(xì)辛脂素對(duì)照品 （純度100.0%，批號(hào)111889-201504）、原兒茶酸 （純度99.9%，批號(hào)110809-201205）、原兒茶醛 （純度99.3%，批號(hào)110810-201608），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；去離子水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak MG Ⅱ C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-1%冰醋酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：287nm；柱溫：35℃；流速：1mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。流動(dòng)相按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 乙腈-1%冰醋酸溶液梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取細(xì)辛脂素對(duì)照品15.25mg、原兒茶酸對(duì)照品20.90mg、原兒茶醛對(duì)照品10.59mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10粒內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲處理45min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 按“2.2.2”節(jié)方法的用量比例分別配制陰性對(duì)照溶液、除丁香葉陰性對(duì)照溶液、除細(xì)辛陰性對(duì)照溶液。分別取對(duì)照品混合溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、除丁香葉陰性對(duì)照溶液及除細(xì)辛陰性對(duì)照溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，主成分峰分離度良好，主成分與雜質(zhì)能得到很好分離，原輔料均無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)液相色譜圖

2.2.4 線性范圍考察 精密吸取對(duì)照品貯備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 置 10mL 量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。細(xì)辛脂素的回歸方程：Y=1.27×106X+789.25（r=0.999 9）；原兒茶酸的回歸方程：Y=8.25×105X-214.23 （r=0.999 9）； 原兒茶醛的回歸方程：Y=1.84×106X-42.99（r=0.999 9）。

結(jié)果表明，細(xì)辛脂素在0.015 25～0.152 5mg·mL-1、原兒茶酸在 0.020 88～0.208 8mg·mL-1、原兒茶醛在0.010 52～0.1052mg·mL-1的范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20170903）供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果細(xì)辛脂素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.46%，原兒茶酸峰面積RSD為0.47%，原兒茶醛峰面積RSD為0.51%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液 10μL， 分別在 0、2、4、8、12、24h 各進(jìn)樣一次，測(cè)定峰面積，細(xì)辛脂素、原兒茶酸、原兒茶醛的RSD分別為1.36%、1.13%、1.18%。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20170903）供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果細(xì)辛脂素平均含量為2.74mg/粒，RSD為1.67%；原兒茶酸平均含量為4.71mg/粒，RSD為1.59%；原兒茶醛平均含量為2.56mg/粒，RSD 為1.43%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批己知含量供試品（平均裝量 0.4551 g，批號(hào) 20170903）6 份，每份約0.3 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密加入一定量的3種成分的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定細(xì)辛脂素、原兒茶酸、原兒茶醛的含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.9 樣品測(cè)定 取3批次樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別測(cè)定含量，并按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[4]采用紫外分光光度法測(cè)定原兒茶酸的含量，以作比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)中對(duì)對(duì)照品混合溶液進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)細(xì)辛酯素最大吸收波長(zhǎng)為287 nm，原兒茶醛最大吸收波長(zhǎng)為313nm、278nm，原兒茶酸最大吸收波長(zhǎng)為294 nm、259nm；根據(jù)樣品中3個(gè)主成分的含量、峰面積及其他物質(zhì)的影響，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm。

實(shí)驗(yàn)中參考《中國(guó)藥典》細(xì)辛項(xiàng)下細(xì)辛脂素[4]的含量測(cè)定方法，采用乙腈-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸和原兒茶醛峰形嚴(yán)重拖尾。而采用乙腈-1%冰醋酸作為流動(dòng)相，峰形較好，理論板數(shù)也較高，陰性無(wú)干擾。因原兒茶醛和細(xì)辛脂素保留時(shí)間相距較大，且兩個(gè)對(duì)照品峰間雜質(zhì)較少，減少試驗(yàn)時(shí)間，并獲得較好的分離效果，因此流動(dòng)相采用梯度洗脫法。

表2 加樣回收率結(jié)果（n=6）

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（n=2）

在前處理的過(guò)程中，分別用甲醇、70%乙醇和甲醇-1%冰醋酸（70∶30）處理樣品，結(jié)果甲醇處理后得到的樣品雜質(zhì)最少，有效成分也提取完全。

將本研究方法測(cè)得的原兒茶酸含量與原標(biāo)準(zhǔn)含量比較，發(fā)現(xiàn)本法原兒茶酸含量明顯低于原標(biāo)準(zhǔn)，而RSD明顯好于原標(biāo)準(zhǔn)，這是因?yàn)樽贤夥止夤舛确▽傩暂^差，操作繁瑣，誤差較大，并不能真實(shí)反映供試品中原兒茶酸的含量。