楊東升，李佳偉，劉婷婷，楊圓圓，李 鵬

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院生物工程系，海南海口 570228）

酯由醇和有機(jī)酸縮合而成，對(duì)于乙酸酯，乙酸（?；鵆OA）是酸殘基，乙醇或高級(jí)醇充當(dāng)醇的部分。中鏈脂肪酸乙酯由中鏈脂肪酸和乙醇或高級(jí)醇構(gòu)成。如上所述，大部分的高級(jí)醇形成于發(fā)酵的初期，因?yàn)檫@些組分要用來合成酯，所以高級(jí)醇要先于酯被合成，酯合成被推遲了。按照乙酰輔酶A池的碳源流向理論，當(dāng)酵母菌生長(zhǎng)開始下降時(shí)，酯的形成開始顯著增長(zhǎng)[1]。高級(jí)醇是酯類的重要合成底物，揮發(fā)性酯類是乙酰輔酶A 和高級(jí)醇之間通過酶促反應(yīng)形成的[2]?？偞己涂傰ナ瞧【浦凶钪饕娘L(fēng)味物質(zhì)。它們之間的協(xié)調(diào)性直接體現(xiàn)了酒體的口感與量化指標(biāo)。醇與酯之間有著50%的轉(zhuǎn)化關(guān)系，有著相應(yīng)的線性回歸關(guān)系。通過酒體中醇類的總量在一定程度上可以判斷酯產(chǎn)生的總量[3]。

CO2是啤酒發(fā)酵過程中生成的氣體物質(zhì)，與酵母的代謝作用密切相關(guān)。由于啤酒發(fā)酵工藝的改進(jìn)，現(xiàn)在大多采用錐底圓柱密封罐取代了原先使用的傳統(tǒng)敞口式發(fā)酵罐。CO2在啤酒發(fā)酵時(shí)對(duì)啤酒發(fā)酵進(jìn)程和質(zhì)量的影響日益突出[1]。CO2還能影響酵母的代謝途徑，改變代謝產(chǎn)物的種類、生成速率和產(chǎn)量[4]。CO2對(duì)高級(jí)醇產(chǎn)生有抑制作用，即使相同的麥汁和菌種，利用溫度和壓力的共同作用，控制酯的生成，也可以生產(chǎn)出風(fēng)味不同的啤酒。改變發(fā)酵壓力和溫度，可以對(duì)酵母生長(zhǎng)、CO2產(chǎn)生量、高級(jí)醇和酯的最終濃度和生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生一定的影響，促成最佳的發(fā)酵條件，使釀造的啤酒具有適宜的風(fēng)味。

研究啤酒背壓發(fā)酵過程中，高級(jí)醇與酯的相關(guān)性，能為產(chǎn)品質(zhì)量調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)，有利于啤酒風(fēng)味改善，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)通過控制比較啤酒背壓發(fā)酵與常壓發(fā)酵，研究CO2背壓對(duì)啤酒中酯和高級(jí)醇生成相關(guān)性的影響。同時(shí)研究了貯藏期中啤酒的酯和高級(jí)醇含量的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

菌種：釀酒酵母，Saccharomyces cerevisiaeNCYC 1108，海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

麥汁：12 °Bx，海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

發(fā)酵設(shè)備：100 L 啤酒自釀系統(tǒng)，哈爾濱漢德啤酒有限公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

背壓發(fā)酵：高泡期形成后，關(guān)閉排空閥，使壓強(qiáng)自動(dòng)上升至0.05 MPa，保持，如果壓力繼續(xù)升高，則通過排氣保持壓力，發(fā)酵溫度10 ℃，時(shí)間10 d，貯藏溫度2 ℃，時(shí)間18 d。常壓發(fā)酵：排空閥保持常開，發(fā)酵溫度10 ℃，時(shí)間10 d，貯藏溫度2 ℃，時(shí)間18 d。

乙醇檢測(cè)：采用蒸餾密度瓶法[5]。

高級(jí)醇和酯的檢測(cè)：采用頂空氣相色譜HP6890N（FID 檢測(cè)器）測(cè)定正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯含量。采用毛細(xì)管HP-NIONAX 柱（30 m×0.32 mm×0.25 μ m 膜厚）和頂空采樣器HP7694E。實(shí)驗(yàn)條件如下：注入溫度為225 ℃；柱溫程序，在40 ℃下保持3 min，然后以5 ℃/min升溫到90 ℃；檢測(cè)器溫度，300 ℃；載氣，氮?dú)?；載氣流量，30 mL/min；氫氣流量，40 mL/min；空氣流量，400 mL/min；分流比，6∶1；樣品瓶平衡溫度，50 ℃；平衡時(shí)間，30 min；循環(huán)溫度，60 ℃；傳輸線溫度，65 ℃。工作站軟件PG2070AA[6-7]。

感官評(píng)價(jià)方法：參照啤酒分析方法（GB/T 4928—2008），按照啤酒DGL-質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行啤酒的感官評(píng)價(jià)[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)取3 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。相關(guān)性分析采用SAS9.0 統(tǒng)計(jì)軟件。其中P＜0.01，r 值較大，兩因素極顯著相關(guān)；P＜0.05，r 值較大，兩因素顯著相關(guān)；P＜0.10，r值較大，兩因素相關(guān)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2背壓及常壓啤酒發(fā)酵中總酯、高級(jí)醇含量變化

主發(fā)酵開始時(shí)即進(jìn)行加壓發(fā)酵，對(duì)啤酒酵母的繁殖和發(fā)酵強(qiáng)度進(jìn)行適當(dāng)抑制，能夠?qū)崿F(xiàn)抑制某些發(fā)酵副產(chǎn)物的形成，達(dá)到保持啤酒風(fēng)味和質(zhì)量的目的。本實(shí)驗(yàn)實(shí)施CO2背壓及常壓啤酒發(fā)酵，總酯、高級(jí)醇含量變化如圖1。

圖1 CO2背壓及常壓啤酒發(fā)酵中總酯、高級(jí)醇含量變化

如圖1 所示，常壓發(fā)酵條件下，高級(jí)醇和總酯含量在80～100 h 達(dá)到高峰，而在背壓條件下，要在180～200 h 才能達(dá)到高峰。在240 h 后，高級(jí)醇含量減少量達(dá)20 %，總酯含量減少量達(dá)29 %。背壓發(fā)酵可較好地解決溫度、酵母增殖及高級(jí)醇等副產(chǎn)物之間的關(guān)系，形成合適的醇酯比[10]。背壓發(fā)酵能顯著降低高級(jí)醇的生成[4，11]和總酯的生成[4]。

圖2 CO2背壓啤酒發(fā)酵中總酯、高級(jí)醇含量減少率

圖2 顯示，CO2背壓引起總酯、高級(jí)醇含量減少率的變化情況。在20～40 h 時(shí)，總酯比高級(jí)醇減少明顯，40～240 h 時(shí)，總酯與高級(jí)醇減少率基本同步。文獻(xiàn)指出，高級(jí)醇的含量是酯類合成的主要限制因子[12]，因此高級(jí)醇減少勢(shì)必引起總酯的減少。

2.2 CO2背壓及常壓啤酒發(fā)酵中高級(jí)醇含量與總酯含量的相關(guān)性

背壓發(fā)酵使發(fā)酵液中飽和二氧化碳的濃度增加，酵母α-氨基氮的同化作用受到抑制，阻礙了酵母的代謝和生長(zhǎng)，阻礙高級(jí)醇的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制了總酯的生成。圖3 顯示了常壓啤酒發(fā)酵過程中，總高級(jí)醇含量與總酯含量的相關(guān)性。圖4 顯示了CO2背壓啤酒發(fā)酵過程中，高級(jí)醇含量與總酯含量的相關(guān)性。

圖3 顯示，常壓條件下啤酒發(fā)酵中總高級(jí)醇含量與總酯含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r=0.97199。背壓條件下，啤酒發(fā)酵中總高級(jí)醇含量與總酯含量同樣呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r=0.98994。增大發(fā)酵壓力，一方面可抑制麥汁中氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨脫羧還原成高級(jí)醇，另一方面可抑制酵母對(duì)麥汁中糖的發(fā)酵，減少生成高級(jí)醇的中間產(chǎn)物——丙酮酸的分解量，從而抑制高級(jí)醇類的生成。由于CO2濃度的提高，還可抑制酵母代謝形成過量的酯[13]。圖5 顯示了由于CO2背壓的影響，總高級(jí)醇含量減少率與總酯含量減少率的相關(guān)性。

圖3 常壓啤酒發(fā)酵總高級(jí)醇含量與總酯含量的相關(guān)性

圖4 CO2背壓啤酒發(fā)酵高級(jí)醇含量與總酯含量的相關(guān)性

圖5 總高級(jí)醇含量減少率與總酯含量減少率的相關(guān)性

CO2背壓同時(shí)使總高級(jí)醇和總酯含量減少，它對(duì)二者減少的影響程度如圖5 所示?？偢呒?jí)醇含量減少率與總酯含量減少率呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），r=0.8356。啤酒主發(fā)酵期間，CO2背壓使總高級(jí)醇和總酯同時(shí)減少，幅度相當(dāng)（圖1）。

2.3 啤酒貯藏期間CO2背壓對(duì)總酯含量和總高級(jí)醇含量的影響

啤酒貯藏期間，酵母失去活力，保持CO2背壓和常壓對(duì)啤酒進(jìn)行分別貯藏，總酯和總高級(jí)醇含量分別發(fā)生變化如圖6所示。

圖6 啤酒貯藏期間總酯含量和總高級(jí)醇含量的變化

無論常壓還是背壓貯藏，總高級(jí)醇含量呈緩慢下降趨勢(shì)，總酯含量呈緩慢上升趨勢(shì)。常壓下貯藏高級(jí)醇含量減少可以解釋為揮發(fā)，而背壓下貯藏高級(jí)醇含量的減少只能解釋為轉(zhuǎn)化。高級(jí)醇可以通過酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酯類[14]。

啤酒貯藏期間CO2背壓對(duì)總酯含量和總高級(jí)醇含量減少率的影響如圖7 所示，在10 ℃溫度下，貯藏14～18 d，0.05 MPa CO2背壓使總酯減少率從18 %下降至13 %，總高級(jí)醇減少率從9 %下降至8 %。總量變化如圖6 所示，常壓貯藏使總酯含量增加0.82 %，總高級(jí)醇含量減少6.29 %；0.05 MPa背壓貯藏使總酯增加6.98 %，總高級(jí)醇減少4.83%。分析表明，雖然啤酒酵母在貯酒期間已失去活力，但總酯在這期間的增加可能仍然是以高級(jí)醇為底物合成的結(jié)果，CO2背壓可能強(qiáng)化酯化反應(yīng)。

圖7 啤酒貯藏期間CO2背壓對(duì)總酯含量和總高級(jí)醇含量減少率的影響

2.4 CO2背壓對(duì)啤酒感官質(zhì)量的影響

啤酒經(jīng)18 d 貯藏，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，綜合氣味、口感、豐滿性、苦味、殺口力等指標(biāo)得分，結(jié)果如表1。CO2背壓發(fā)酵有效控制了主發(fā)酵期高級(jí)醇的生成，并通過后熟和貯藏增加了酯的合成，形成了較合理的醇酯比，使啤酒氣味和口感優(yōu)于常壓發(fā)酵。背壓發(fā)酵對(duì)啤酒的豐滿性和苦味并無影響，由于增加了CO2的溶解，使殺口力明顯增強(qiáng)。從綜合得分看，CO2背壓對(duì)啤酒感官質(zhì)量的影響是非常大的。通過控制啤酒釀造過程中的一系列條件，高級(jí)醇與酯的含量可以大致地控制在人們所希望的濃度范圍內(nèi)，從而形成較佳的感官質(zhì)量。

表1 啤酒感官評(píng)價(jià)表 得分（分）

3 結(jié)論

3.1 常壓與CO2背壓條件下啤酒發(fā)酵中總高級(jí)醇含量與總酯含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3.2 CO2背壓條件相比于常壓啤酒發(fā)酵同時(shí)令總高級(jí)醇和總酯減少，總高級(jí)醇含量減少率與總酯含量減少率呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3.3 CO2背壓啤酒貯藏期間可能強(qiáng)化酯化反應(yīng)，使總高級(jí)醇含量減少，總酯含量增加，提高啤酒的感官質(zhì)量。