趙曉惠，施錦婷，2，張建恒，3，康新宇，丁曉瑋，何培民，3，文欽琳，楊曉倩

（1.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306；2.高知大學(xué)海洋植物學(xué)研究室，日本高知 783-8502；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222005）

滸苔（Enteromorpha/Ulva prolifera）原屬于綠藻門，綠藻綱，石莼目，石莼科，滸苔屬（Enteromorpha），近年來(lái)國(guó)際上根據(jù)分子研究結(jié)果已傾向把滸苔屬歸為石莼屬（Ulva）。它廣泛分布于中、低潮區(qū)的砂礫、巖石、灘涂和石沼海岸中。滸苔藻體含有許多人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分，自古以來(lái)即作為食用和藥用植物［1-2］，日本已大規(guī)模養(yǎng)殖，其產(chǎn)品價(jià)格在海藻中最高［3］。近十幾年以來(lái)，許多國(guó)家都受到綠潮災(zāi)害的影響，其已成為全球性的海洋環(huán)境問(wèn)題［4-5］。2008年，滸苔引發(fā)了我國(guó)黃海大規(guī)模綠潮暴發(fā)［6-7］，直接威脅2008年青島奧帆賽舉辦，此后則成為我國(guó)黃海年年暴發(fā)綠潮主因［8-9］。目前，滸苔生活史、生理生態(tài)學(xué)、發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)等關(guān)鍵問(wèn)題正在深入研究，并且研究重點(diǎn)已開(kāi)始轉(zhuǎn)向功能基因分析與精細(xì)定位及分子遺傳學(xué)等關(guān)鍵問(wèn)題，因此滸苔染色體制備及核型分析研究越來(lái)越重要且十分迫切。

染色體制片和核型分析是研究重要功能基因定位、物種演化與分類、染色體遺傳學(xué)等的重要環(huán)節(jié)［10-11］。由于大型海藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，采用傳統(tǒng)染色體蘇木精染色制備十分困難，至今僅海帶和紫菜染色體制備和分型比較成功［12-13］。COLL等［14］最早采用釩鐵蘇木精染液對(duì)紫菜屬的Porphyra leucosticta染色體核型進(jìn)行研究，并且通過(guò)觀察條斑紫菜（Porphyra yezoensis）和壇紫菜（Porphyra haitanensis）的殼孢子及其第1次和第2次萌發(fā)細(xì)胞染色體數(shù)目，才首次確認(rèn)了紫菜減數(shù)分裂發(fā)生位置［15-16］。周偉等［17］采用蘇木精染色可清晰地看到條斑紫菜和壇紫菜葉狀體細(xì)胞分別為3條和5條染色體、絲狀體細(xì)胞分別為6條和10條染色體。劉宇等［12］利用酶解-熒光法成功制備海帶染色體，并可清晰辨認(rèn)和分析核型；王浩東［18］最早嘗試使用蘇木精染色和常規(guī)壓片法進(jìn)行滸苔染色制備和觀察研究，但滸苔染色體制作效果較差，難以準(zhǔn)確進(jìn)行倍性及核型分析。

為此，本研究借鑒海帶染色體制備方法，采用酶解-熒光法探索滸苔染色體制備方法，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究出綠藻滸苔染色體制備過(guò)程中的3個(gè)關(guān)鍵條件，并獲得了滸苔染色體核型清晰圖譜，以期為未來(lái)滸苔遺傳特征分析以及滸苔基因定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

本實(shí)驗(yàn)選用材料為滸苔，于2018年5月采自江蘇如東紫菜養(yǎng)殖區(qū)域，滸苔雌、雄配子體和孢子體由經(jīng)典生活史方法進(jìn)行判定［19］。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好的藻體，在溫度為20℃、光照強(qiáng)度為130～150μmol·m-2·s-1、光照周期為12 L∶12 D條件下，于盛有400 mL VSE培養(yǎng)液［20］的三角瓶中充氣培養(yǎng)，每周更換一次培養(yǎng)基。

1.2 染色體的制備

分別取1 cm生長(zhǎng)狀態(tài)良好的滸苔雌、雄配子體及孢子體，用滅菌海水清洗3～5次，放入1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1離心2 min，去除多余水分，加入1 mL質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素［12］振蕩搖勻，于4℃靜置處理，并設(shè)置不同處理時(shí)間，分別為 4、8、12、16、20 h，以確定最適處理時(shí)間。

取秋水仙素處理的藻體，用去離子水漂洗2～3次，離心得沉淀；加入卡諾固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）充分混勻后，于4℃處理24 h，將藻體細(xì)胞固定于有絲分裂中期，后離心得沉淀，用去離子水漂洗3次，離心取沉淀藻體，放入1.5 mL離心管中，加入質(zhì)量濃度都為2%的纖維素酶、果膠酶、離析酶各100μL，充分混勻后放入37℃水浴鍋中酶解4～24 h，設(shè)置不同梯度酶解時(shí)間分別為 4、8、12、16、20、24 h，以確定最適宜酶解時(shí)間；然后用70%的乙醇終止酶解反應(yīng)，并用蒸餾水將酶解后的藻體漂洗3次，去除乙醇，離心得酶解產(chǎn)物沉淀，加入100μL冰乙酸并充分振蕩混勻，取少量酶解產(chǎn)物，設(shè)置不同高度（10、30、50 cm）進(jìn)行高位滴片，室溫自然晾干。

1.3 染色體的觀察與核型初步分析

取攜帶有染色體的自然晾干載玻片，避光加15μL DAPI（10μg·mL-1）溶液，蓋上蓋玻片，染色15 min后，在熒光顯微鏡（Leica DM4000B/DFC550，德國(guó)）下觀察，將圖片拍照保存。根據(jù)染色體數(shù)目判定標(biāo)準(zhǔn)：統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)目應(yīng)在30個(gè)以上，其中85%以上的細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認(rèn)為是該植物的染色體數(shù)目［21］。取5個(gè)典型中期細(xì)胞，測(cè)量并計(jì)算染色體絕對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度和總長(zhǎng)度及各平均值，計(jì)算方法參見(jiàn)李懋學(xué)等［21］的核型分析標(biāo)準(zhǔn)；最后根據(jù)染色體絕對(duì)長(zhǎng)度，利用Adobe Photoshop軟件按照由大到小順序?qū)G苔細(xì)胞染色體進(jìn)行編號(hào)并排序［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理時(shí)間對(duì)染色體制備的影響

秋水仙素能有效抑制紡錘體的形成，秋水仙素處理時(shí)間對(duì)染色體分裂相、染色體濃縮程度及染色體形態(tài)有較大影響（圖1）。秋水仙素處理時(shí)間表明：若處理時(shí)間過(guò)短（＜8 h），染色體大部分還處于染色質(zhì)狀態(tài)，難以清晰分辨染色體個(gè)體（圖1-A，B）；若處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（＞16 h），造成染色體縮得過(guò)短，成極小的圓點(diǎn)狀，顯示不出染色體之間的差異（圖1-D）；對(duì)于處理12 h左右的滸苔細(xì)胞，其染色體分裂相較多，染色體濃縮程度適宜，分散均勻，形態(tài)清晰（圖1-C）。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)染色體制備的影響

酶解程度的好壞直接影響到制片染色體的質(zhì)量（圖2），若酶解時(shí)間過(guò)短（＜16 h）（圖2-A～D），細(xì)胞壁酶解不完全，細(xì)胞質(zhì)有殘留，細(xì)胞分散不均勻，染色體形態(tài)不易觀察；若酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（＞20 h）（圖2-F），則染色體被降解，同樣不能清楚觀察染色體形態(tài)；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酶解20 h左右效果最好（圖2-E），能去除細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和多糖物質(zhì)，使細(xì)胞分散均勻，染色體呈清晰點(diǎn)狀或棒狀。

圖1 秋水仙素處理時(shí)間對(duì)滸苔染色體制備的影響Fig.1 Effect of different colchicine preparation time on chromosome preparation

圖2 酶解時(shí)間對(duì)染色體制備的影響Fig.2 Effect of different enzym atic hydrolysis time on chromosome preparation

2.3 滴片高度對(duì)染色體制備的影響

滴片的作用主要是打破細(xì)胞外被和核膜，使染色體較好地分散在載玻片上以便于觀察。不同高度進(jìn)行滴片，能獲得不同的染色體制片效果。結(jié)果顯示，在10 cm左右高度下滴片（圖3-A），染色體背景較模糊，不能使染色體較好的分散，不利于染色體的觀察。當(dāng)?shù)纹叨葹?0 cm左右時(shí)（圖3-B），能有效地分散染色體，獲得較容易觀察的染色體。而當(dāng)高度大于50 cm（圖3-C）進(jìn)行滴片，染色體較為分散，很難區(qū)分單個(gè)細(xì)胞染色體。

2.4 核型初步分析

通過(guò)不斷優(yōu)化滸苔染色體制片方法后，獲得清晰的滸苔染色體分裂相，其染色體分散較均勻，形態(tài)較清晰（圖4）。本實(shí)驗(yàn)分別選取80個(gè)滸苔雌、雄配子體和孢子體細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目的確定，93%（超過(guò)85%）的細(xì)胞染色體數(shù)目為雌、雄配子體n=9，孢子體2n=18。再按照染色體絕對(duì)長(zhǎng)度由大到小進(jìn)行染色體核型的初步分析（圖4-D～F），統(tǒng)計(jì)5個(gè)中期細(xì)胞分裂相，雌性配子體的染色體絕對(duì)長(zhǎng)度（表1）為1.249～3.490 μm，染色體總長(zhǎng)度為21.286μm，平均長(zhǎng)度為2.265μm；雄性配子體的染色體絕對(duì)長(zhǎng)度為1.375～2.875μm，染色體總長(zhǎng)度為 18.044μm，平均為2.005μm；雌配子體的染色體長(zhǎng)度略大于雄配子體染色體，但他們的相對(duì)長(zhǎng)度之間沒(méi)有顯著性差異。孢子體染色體的絕對(duì)長(zhǎng)度為1.188～2.125μm，總長(zhǎng)度為 26.242μm，平均長(zhǎng)度為1.458μm。

圖3 不同高度滴片對(duì)染色體制備的影響效果Fig.3 Effect of different drop heights on chromosome preparation

圖4 滸苔雌、雄配子體及孢子體的染色體及其核型分析Fig.4 Chromosome images of the female，male gametophytes and sporophytes of U.prolifera and analysis of karyotypes

表1 滸苔雌、雄配子體及孢子體染色體長(zhǎng)度（M eans±SD，n=5）Tab.1 Index of karyotype of U.prolifera

3 討論

雖然目前植物染色體制片技術(shù)已較為成熟，但常規(guī)染色體制片技術(shù)仍存在不足之處［23-24］，而滸苔染色體很小，增加了對(duì)其染色體的觀察難度，因此要獲得分散良好且清晰的中期分裂相，需要對(duì)影響染色體制備過(guò)程的每一個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行最適范圍摸索。預(yù)處理可破壞和抑制紡錘體中微管的形成，使中期分裂相的數(shù)量增加，促使染色體濃縮變短，利于染色體分散［25-26］。可用作預(yù)處理的藥物很多，如秋水仙素、對(duì)二氯苯、8-羥基喹啉、α-溴萘、冰水等［10］，但不同植物進(jìn)行預(yù)處理的最佳方式不同。楊玲等［25］利用對(duì)二氯苯-α-溴萘混合液預(yù)處理沙田柚根尖制片效果最好；李艷輝等［27］用8-羥基喹啉處理皺葉酸模，染色體制片效果最好；劉宇等［12］和唐歷波等［28］分別以秋水仙素作為預(yù)處理試劑處理海帶和白木香，取得了很好的染色體制片效果。由于滸苔與海帶同屬海藻，本研究選用秋水仙素作為預(yù)處理試劑，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度秋水仙素以及不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)制片效果的影響，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度對(duì)預(yù)處理效果影響不大，但其處理時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響，因此選取質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素［12］，本研究得出的秋水仙素最適預(yù)處理時(shí)間為12 h，這樣可以積累大量處于分裂中期的染色體［29-30］。

固定劑可以中止細(xì)胞中的酶解反應(yīng)或其他代謝活動(dòng)，防止抗原丟失或被破壞，并保持細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)［26］，本研究所選用的卡諾固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1），目的是為了穩(wěn)定染色體的結(jié)構(gòu)，防止其分解，便于顯微觀察。研究結(jié)果表明，卡諾固定時(shí)間對(duì)制片效果無(wú)顯著影響，但染色體在4℃下處理24 h，固定效果最佳，這與劉宇等［12］制備海帶染色體的條件一致。

解離可以除去細(xì)胞間的果膠層并軟化、破壞細(xì)胞壁［31］。不同的植物材料，解離液的選擇和解離時(shí)間大不相同［32-33］，GILL等［34］用纖維素酶和果膠酶溶解細(xì)胞壁；陳瑞陽(yáng)等［35］提出了酶解去壁低滲的制片方法，制片的染色體分散較好、形態(tài)較平整；劉宇等［12］用秋水仙素多種酶處理獲得清晰的海帶染色體。本研究所選用的解離方法為酶解法，在多種酶的作用下，經(jīng)過(guò)酶解和壓片后，分生細(xì)胞的原生質(zhì)體從細(xì)胞壁中脫離出來(lái)，使得染色體周圍不帶細(xì)胞質(zhì)或僅有少量細(xì)胞質(zhì)，從而得到細(xì)胞背景干凈、染色體分散較好的制片效果［10，12，36］。本研究酶解所用的每一種酶都是必不可少的，纖維素酶是一種在分解纖維素時(shí)起生物催化作用的酶，可以將纖維素分解為寡糖或單糖；果膠酶是從根霉中提取的，使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解；離析酶的主要作用是把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來(lái)，成為單細(xì)胞。酶解程度的好壞直接影響到染色體的質(zhì)量，為了獲得高質(zhì)量的染色體分裂相，本研究通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)得出最適酶解時(shí)間，即質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶、果膠酶、離析酶，混合酶解20 h所得染色體質(zhì)量最高。

滴片的作用主要是打破細(xì)胞外被和核膜，使染色體較好地分散在載玻片上以便于觀察。不同高度滴片能獲得不同的染色體制片效果，本研究發(fā)現(xiàn)，若滴片高度低于30 cm，染色體背景較模糊，不能使細(xì)胞較好的分散，不利于染色體的觀察；若滴片高度高于30 cm，則細(xì)胞與染色體較為分散，很難區(qū)分單個(gè)細(xì)胞染色體；只有在30 cm的滴片高度下才能獲得高質(zhì)量的染色體。此外，本實(shí)驗(yàn)選用靈敏度高、特異性的DAPI用于染色體的顯帶，方法簡(jiǎn)便，分辨率也很高［37］。DAPI復(fù)合物發(fā)出的熒光為淺藍(lán)色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高，發(fā)出的熒光更加穩(wěn)定，便于顯微照相［38］。

綜上可知，影響滸苔染色體制片優(yōu)劣的因素有很多，染色體制備過(guò)程中的每一步都十分關(guān)鍵。染色體制片的目的就是獲得高質(zhì)量的染色體，為后續(xù)的核型分析和原位雜交等研究提供先決條件。本研究發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)量濃度為0.2%的秋水仙素處理12 h，在獲得大量處于分裂中期的染色體的基礎(chǔ)上，用質(zhì)量濃度為2%的纖維素酶、果膠酶、離析酶，混合酶解20 h，在30 cm高度下滴片，可以獲得質(zhì)量較高的染色體分裂相，所得滸苔雌、雄配子體染色體均為9條，孢子體的染色體為18條，呈短棒狀或點(diǎn)狀，并按照大小順序?qū)θ旧w的核型進(jìn)行了初步分析，此結(jié)果為滸苔染色體進(jìn)行核型分析以及滸苔基因定位研究奠定了基礎(chǔ)，也可為未來(lái)滸苔全基因組的進(jìn)一步分析提供重要依據(jù)。