細鱗鮭對谷氨酸行為趨向的反應(yīng)閾值

蔡紅英，魏 凱，陳春山，張旭光，郭弘藝，李 超，時 曉

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.北京市水生野生動植物救護中心，北京 102100；3.北京市鱘魚鮭鱒魚創(chuàng)新團隊，北京 102100；4.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

細鱗鮭（Brachymystax lenok）是我國一種名貴的陸封型鮭科魚類［1］。目前，由于多種人為原因，細鱗鮭的分布區(qū)域逐漸縮小，野生資源量急劇下降。為了保護和恢復細鱗鮭野生資源，研究人員開展了大量對其自然資源養(yǎng)護［2-4］、人工繁殖和養(yǎng)殖實驗研究［5-6］。在魚類人工養(yǎng)殖中，適口性是配合飼料能被魚類迅速攝食和吸收的重要前提［7］。隨著動物蛋白成本的提高，在魚類配合飼料中增加植物蛋白成為一個必然的趨勢［8］。然而，配合飼料中植物蛋白的比例增加可能會引起飼料的適口性下降，因此，需要在飼料中添加促進攝食的引誘物質(zhì)來提高養(yǎng)殖魚類的攝食動機以提高攝食效率［8］。魚類攝食過程主要有3個階段：感知食物、搜索食物和攝入食物［9］。氨基酸可以誘發(fā)魚類攝食相關(guān)的嗅覺行為［10］，被認為是最有效的魚類誘食化合物之一［11］。有研究表明，單體谷氨酸和脯氨酸都可以有效地觸發(fā)紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka）進行嗅覺印跡［12］，說明鮭魚對氨基酸的嗅覺趨向性可能是一種先天性的能力，也印證了氨基酸作為誘食劑的機制。細鱗鮭對多種氨基酸的行為反應(yīng)研究表明，其對谷氨酸有較強的行為趨向性［3］。這種趨向性行為可以看作魚類攝食過程中感知并趨向食物的階段。但是細鱗鮭的行為正趨向的程度與氨基酸的濃度相關(guān)性仍不清楚。本文以細鱗鮭為研究對象，通過自制的Y形迷宮水槽研究了細鱗鮭對不同濃度谷氨酸的選擇偏好性，以期獲得細鱗鮭嗅覺行為敏感的最佳氨基酸濃度，為細鱗鮭誘食劑的開發(fā)利用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚為取自吉林省延邊細鱗鮭良種場當年孵化的細鱗鮭幼魚，共計60尾，平均體質(zhì)量為（250.0±2.4）g，平均體長為（24.0±1.8）cm。試驗魚置于實驗室的帆布循環(huán)水槽（1m×Ф1.6 m）中暫養(yǎng)，水溫由冷水機控制為（13±1）℃，正常自然光照，暫養(yǎng)期間每日投喂一次人工顆粒餌料，適量換水以保持水體清潔。實驗時隨機撈取健康的魚進行實驗。

1.2 實驗方法

實驗在自制的Y型迷宮水槽（76 cm×36 cm×20 cm）中進行，水深10 cm，水槽的一端設(shè)置長30 cm的檔板將水槽一端分成2個相同的Y形選擇臂槽，選擇臂槽通過導管與刺激液水槽相連，通過調(diào)節(jié)閥控制刺激液以相同的流速進入選擇臂槽（圖1）。在水槽的另一端設(shè)置了出水口，并通過調(diào)節(jié)閥控制水流速度，以調(diào)節(jié)刺激液在選擇臂的擴散速度。根據(jù)有色溶液擴散類比，20 mL溶液擴至選擇臂末端的時間約為3 min，由此確定了視頻記錄時間為3min，以避免2個選擇臂內(nèi)刺激液混和。實驗時，隨機撈取1尾試驗魚到實驗水槽，并由活動網(wǎng)隔離在選擇臂前方適應(yīng)15 min后移去活動網(wǎng)，同時打開氨基酸刺激液和對照組水溶液（與暫養(yǎng)用水同）的進水閥，并開始記錄試驗魚的行為反應(yīng)，視頻文件保存在電腦中進行離線分析。谷氨酸刺激液分別配制濃度為1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mol·L-1的5組母溶液。理論上，谷氨酸母溶液擴散至選擇臂末端的最大實際濃度分別為3.7×10-5、3.7×10-6、3.7×10-7、3.7×10-8、3.7×10-9mol·L-1，濃度數(shù)量級為 1×10-5～1×10-9。實驗時，不同濃度谷氨酸母溶液和對照組水溶液隨機加入不同的刺激液槽內(nèi)，以減少位置信息對實驗結(jié)果的影響。每組實驗分別測試了10尾細鱗鮭幼魚對不同濃度谷氨酸的嗅覺行為反應(yīng)。每次實驗結(jié)束，試驗魚置于暫養(yǎng)水槽的隔離網(wǎng)籠內(nèi)，并沖洗實驗水槽，更換新水進行下一次實驗。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗中，細鱗鮭幼魚對不同濃度谷氨酸的趨向反應(yīng)可表現(xiàn)3個階段：首先是對味道信息的感知，主要表現(xiàn)出游向選擇臂的動機，比如頭部轉(zhuǎn)向選擇臂或胸鰭扇動速度增加；進而選擇進入或遠離選擇臂槽；最后在選擇臂槽停留或搜尋。依據(jù)試驗魚的行為反應(yīng)，對試驗魚的初次行為反應(yīng)進行定性評分［13］：實驗開始后，試驗魚改變原先身體方向，游向選擇臂或頭部轉(zhuǎn)向特定的選擇臂，可看到胸鰭扇動速度增加，但并沒有進入選擇臂時，可視為1分；試驗魚頭部或一半身體進入選擇臂內(nèi)時，則視為2分；試驗魚整個身體全部進入選擇區(qū)視為3分。在這種打分評價試驗魚選擇性時，只對試驗魚首次的選擇結(jié)果進行評分，而沒有被選擇的組則為0分。通過比較試驗魚對不同刺激液的選擇總分值，可以快速、定性地確定試驗魚對不同濃度谷氨酸的趨向偏好差異。但是這種評價并不能反映試驗魚在選擇臂的停留時間和反復進入次數(shù)等，而且，試驗魚也會改變選擇，而趨向相反的選擇臂［14］。因此，引入偏好度（preference degree）作為試驗魚趨向程度大小的指標［3］。試驗魚對不同濃度谷氨酸刺激液的偏好度定義為P=（n×T）/t。式中，P為偏好度；n為進入選擇臂總次數(shù)；T為在選擇臂的平均停留時間；t為第一次進入選擇臂的反應(yīng)時間或延遲時間。這樣，試驗魚進入選擇臂的次數(shù)越多，停留時間越長或第一次進入反應(yīng)越短，則說明其對刺激液的偏好程度越大。為了更直觀比較試驗魚對不同濃度谷氨酸的趨向性，將每組實驗中試驗魚對水溶液的偏好度定義為1，根據(jù)公式R=PGlu/Pwater進行標準化轉(zhuǎn)化，計算試驗魚對不同濃度谷氨酸的相對偏好度（R），通過比較相對偏好度大小來確定最佳趨向反應(yīng)的谷氨酸濃度，并根據(jù)試驗魚對該濃度的第一次平均反應(yīng)時間確定其嗅覺反應(yīng)閾值。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值 ±標準誤（Mean±SEM），由 Sigmaplot（v 12.5）進行繪圖，并進行顯著性分析（T檢驗）。

圖1 Y型迷宮水槽示意圖Fig.1 Schematic diagram of the Y maze flow system

2 結(jié)果與分析

2.1 行為表現(xiàn)方式

實驗分別測試了細鱗鮭幼魚對5組不同濃度的谷氨酸刺激液的行為反應(yīng)。試驗魚對不同濃度谷氨酸有不同的反應(yīng)。移去擋板后，試驗魚通常會表現(xiàn)緩慢的游泳狀態(tài)或原地擺動尾巴。給予高濃度谷氨酸刺激液時（1×10-5mol·L-1），試驗魚（n=4）有時會表現(xiàn)出快速逃離行為，游到遠離選擇臂的角落，一直至實驗記錄結(jié)束；或表現(xiàn)出急劇的沖撞水槽壁的行為（n=2）；個別試驗魚（n=2）會嘗試再次游向谷氨酸選擇臂，但同樣會快速的逃離，這可能與氨基酸刺激液在水中的不均勻分散有關(guān)；或直接進入對照組選擇臂（n=3）。當給予低濃度的谷氨酸時（1×10-8mol·L-1），試驗魚（n=5）通常選擇進入選擇臂停留或小范圍的轉(zhuǎn)圈游動，有時離開選擇臂繞一圈后再次返回進入有谷氨酸的選擇臂中或進入對照組側(cè)（圖2）。

2.2 嗅覺反應(yīng)閾值

細鱗鮭幼魚對5組不同濃度氨基酸刺激液的行為反應(yīng)得分總值如圖3。在濃度1×10-5mol·L-1谷氨酸刺激液與水的試驗組（以下簡稱為谷氨酸和水）中，試驗魚對谷氨酸刺激液反應(yīng)的平均得分為（0.90±0.27），低于對水溶液的反應(yīng)平均得分（1.20±0.48）（P＜0.05），其中 4尾魚對水溶液的反應(yīng)得分為3分，沒有試驗魚對氨基酸的反應(yīng)得分為3分；在1×10-8mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對谷氨酸的反應(yīng)平均得分（1.56±0.48），高于對水溶液的平均得分（0.67±0.27）（P＜0.05），其中有 4尾魚對氨基酸刺激的反應(yīng)得分為3分；在1×10-6mol·L-1谷氨酸和水及1×10-7mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對水反應(yīng)的平均得分分別為（1.22±0.41）和（1.33±0.42），大于對谷氨酸的反應(yīng)平均得分（0.67±0.35）和（0.89±0.43），但二者沒有顯著性差異（P＞0.05）；在1×10-9mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對谷氨酸的平均得分為（1.11±0.33），大于對水反應(yīng)的平均得分（0.89±0.43），二者沒有顯著性差異（P＞0.05）。在1×10-6、1×10-7、1×10-8mol·L-1谷氨酸的試驗組中，試驗魚對谷氨酸和水溶液的反應(yīng)得分都有3分的情況。

圖2 細鱗鮭幼魚對谷氨酸刺激的行為反應(yīng)模式Fig.2 Behavioral response to am ino acid stimulation in Brachymystax lenok juveniles

圖3 細鱗鮭幼魚對刺激液的行為反應(yīng)得分Fig.3 Response scores of B.lenok juveniles to stim ulus

細鱗鮭幼魚對5組不同濃度氨基酸刺激液的偏好度如圖4所示。在1×10-5mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對1×10-5mol·L-1谷氨酸的偏好度為（0.61±0.23），小于對水的偏好度（1.54±0.93），但二者沒有顯著性差異（P＞0.05）；在1×10-6mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對 1×10-6mol·L-1谷氨酸的偏好度為（0.57±0.18），小于對水的偏好度（1.32±0.52），二者沒有顯著性差異（P＞0.05）；在1×10-7mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對1×10-7mol·L-1谷氨酸的偏好度為（0.38±0.19），小于對水的偏好度（1.01±0.45），二者沒有顯著性差異（P＞0.05）；在1×10-8mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對1×10-8mol·L-1谷氨酸的偏好度為（2.93±0.89），大于對水的偏好度（0.77±0.36），二者有顯著性差異（P＜0.05）；在1×10-9mol·L-1谷氨酸和水中，試驗魚對 1×10-9mol·L-1谷氨酸的偏好度為（1.38±0.81），略大于對水的偏好度（1.20±0.39），二者沒有顯著性差異（P＞0.05）。

根據(jù)標準化轉(zhuǎn)換公式，試驗魚對3.7×10-5～3.7×10-9mol·L-1谷氨酸刺激的相對偏好度分別為 0.396、0.436、0.381、3.801、1.142。根據(jù)試驗魚對谷氨酸刺激液的行為反應(yīng)得分和相對偏好度，試驗魚對實際濃度為3.7×10-8mol·L-1谷氨酸刺激液的行為趨向最強。試驗魚對谷氨酸刺激液的反應(yīng)時間為 18—57 s，平均值為（34.5±9.4）s，根據(jù)溶液擴散，在34.5 s時的選擇臂槽內(nèi)的谷氨酸實際濃度約為0.7×10-8mol·L-1，即細鱗鮭對谷氨酸行為趨向的反應(yīng)閾值為0.7×10-8mol·L-1。

圖4 細鱗鮭幼魚對氨基酸的偏好度Fig.4 Preference degree to am ino acids in B.lenok juveniles

3 討論

目前，魚類配合飼料中誘食劑的研究一直是一個備受關(guān)注的研究課題。外源性氨基酸類物質(zhì)不僅可以滿足魚類的營養(yǎng)需求，而且可以誘發(fā)魚類攝食動機，促進魚類的攝食進程和飼料利用率［11］。如鰻鱺科魚類（Anguillidae）配合飼料行業(yè)標準（SC/T 1004-2004）就明確規(guī)定了蛋氨酸的添加指標［15］。但非必需氨基酸由于動物可以自身合成，在誘食劑的研究中往往被忽略，比如谷氨酸。在氨基酸類誘食劑研究中，常根據(jù)魚類喜食的天然餌料中主要成份來鎖定可能的氨基酸種類［16］。細鱗鮭是典型肉食性魚類，在自然條件下，幼魚期喜食水蚤、搖紋幼蟲等小型生物以及各種落入水中的昆蟲等，成年期也能攝食自己體長1/2的魚類［1］。對其天然餌料中的氨基酸成分分析發(fā)現(xiàn)，谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸是主要的氨基酸［17］。細鱗鮭肌肉中的谷氨酸（1.75%，干重）、天冬氨酸（1.59%）、甘氨酸（0.85%）和丙氨酸（0.75%）也是魚體含量較高的幾類氨基酸［18］。對細鱗鮭棲息河流的主要氨基酸種類調(diào)查發(fā)現(xiàn)，按含量順序分別為谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸等，其中谷氨酸占總量的20%以上［19］。谷氨酸不僅可以對馬蘇大麻哈魚（Oncorhynchusmasou）形成嗅覺印跡［13］，而且可以激活未開口的大西洋鮭（Salmo salar）仔魚的猛沖、咬合等一系列攝食行為［10］。結(jié)合細鱗鮭對氨基酸趨向偏好性的研究結(jié)果，表明谷氨酸也可能成為潛在的細鱗鮭誘食添加劑。

本文通過Y形迷宮實驗研究了細鱗鮭幼魚對谷氨酸的行為趨向，同時通過選擇偏好度［3］和行為特征評分［13］確定其最敏感的氨基酸濃度。實驗結(jié)果表明，細鱗鮭幼魚對1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1谷氨酸刺激液的相對偏好度小于1，表明其更偏向水溶液，對較高濃度的谷氨酸刺激具有回避或負趨向性行為；而對1×10-8、1×10-9mol·L-1谷氨酸母溶液刺激的相對偏好度大于1，表明其更偏向谷氨酸溶液，對較低濃度的谷氨酸刺激具有趨向性行為。行為評分的分值也同樣體現(xiàn)類似的趨向，對1×10-8、1×10-9mol·L-1谷氨酸母溶液刺激的行為分值也高于水溶液。在施氏鱘（Acipenser schrenckii）對幾種氨基酸的誘食活性研究中有類似的結(jié)果，1×10-3、1×10-4mol·L-1的蘇氨酸、精氨酸母溶液刺激對施氏鱘的攝食行為有明顯的抑制性，而母溶液濃度降至1×10-5mol·L-1時，則產(chǎn)生明顯的誘食活性［16］。這也表明高濃度氨基酸濃度對魚類產(chǎn)生抑制行為，而低濃度的氨基酸對魚類具有誘食性。因此，確定魚類對氨基酸的行為反應(yīng)閾值濃度是研究誘食劑的重要前提之一。在本實驗中，細鱗鮭幼魚對實際濃度小于3.7×10-8mol·L-1的谷氨酸刺激表現(xiàn)出正向的行為趨向反應(yīng)。魏凱等［3］研究了細鱗鮭幼魚對幾種氨基酸的嗅覺行為反應(yīng)，谷氨酸實際濃度為2.5×10-6mol·L-1時引起試驗魚明顯的偏好選擇。在本實驗中，試驗魚對實際濃度 3.7×10-6mol·L-1的谷氨酸并沒有明顯的趨向性，且相對偏好度依然小于1。這種看似矛盾的結(jié)果，原因其一可能是實驗中對照組選擇的差異造成，魏凱等［3］采用甘氨酸作為對照組，以確定試驗魚對不同氨基酸的選擇差異，而本實驗中以水溶液作為對照組；其次，本實驗所用的試驗魚個體較大，可能不同生長階段的魚對谷氨酸的反應(yīng)閾值存在差異。SHPARKOVISKY等［20］研究也發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，大西洋鮭對亮氨酸的正趨向性反應(yīng)增加，對纈氨酸和丙氨酸的正趨向性反應(yīng)減少，而精氨酸和組氨酸引起的負趨向性反應(yīng)隨著魚的年齡增長也變得更加明顯。但魚類這種趨向行為的變化是否與其嗅覺敏感性相關(guān)，仍有待進一步的實驗研究。

盡管很多研究證實單體的氨基酸可以誘發(fā)魚類的攝食動機，但也有研究表明單體氨基酸的誘食效果并不好。王常安等［21］在氨基酸對哲羅鮭（Hucho taimen）的誘食研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5%的谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸對哲羅鮭的誘食效果不明顯。這可能是由于添加的氨基酸的劑量不合適，如1×10-3mol·L-1谷氨酸對施氏鱘攝食有明顯抑制性，而1×10-4、1×10-5mol·L-1谷氨酸對其攝食行為的抑制和引誘效果都不顯著。另一方面也說明，相同的氨基酸對不同魚類的作用存在差異。如脯氨酸和丙氨酸可以誘發(fā)褐鱒（Salmo trutta）幼魚的攝食行為［10］，卻是虹鱒（S.garidneri）的抑食物質(zhì)［22］。因此，在誘食劑研究中，需要首先通過行為學和電生理方法，篩選出對魚類具有明顯引誘作用的促攝食物質(zhì)，并確定其反應(yīng)閾值。本文雖然通過行為學的方法確定了細鱗鮭對谷氨酸的趨向行為的反應(yīng)閾值，但還需要經(jīng)過長期的攝食行為和生長實驗來精確驗證。