李兆康 盧 青 丁世芳

目前，心肌缺血-再灌注損傷的機(jī)制仍未被完全闡明。自噬在缺血-再灌注過(guò)程中被上調(diào)，早期可能通過(guò)減少能量消耗和清除受損細(xì)胞器來(lái)保護(hù)心肌，而后期過(guò)度激活則對(duì)心肌有害，關(guān)于自噬在缺血-再灌注中的作用仍存在爭(zhēng)議[1]。縫隙連接蛋白43(Cx43)是心室肌中含量最高的縫隙連接蛋白，除了在細(xì)胞膜上，它還定位在線粒體內(nèi)膜上。線粒體Cx43參與線粒體呼吸鏈的調(diào)節(jié)，維持線粒體的穩(wěn)定；此外，其在缺血預(yù)處理和后處理對(duì)缺血-再灌注心肌的保護(hù)中起關(guān)鍵作用，但關(guān)于線粒體Cx43本身在缺血-再灌注中的變化和作用卻鮮見(jiàn)報(bào)道[2-3]。本研究通過(guò)建立H9c2細(xì)胞缺氧-復(fù)氧(H/R)模型，模擬心肌的缺血-再灌注過(guò)程，試圖探究自噬和線粒體Cx43 在這個(gè)過(guò)程中的變化和相互作用關(guān)系，以期為臨床防治缺血-再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(2-1)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。FBS、高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，格爾德霉素(GA)購(gòu)自APExBIO公司，3-甲基腺嘌呤(3-MA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、細(xì)胞線粒體分離試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔多克隆抗體GAPDH購(gòu)自杭州賢至生物有限公司，兔多克隆抗體Beclin-1、兔多克隆抗體coxⅣ均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔多克隆抗體LC3A/B購(gòu)自美國(guó)Affinity品牌，兔多克隆抗體Cx43、兔多克隆抗磷酸化Cx43(p-Cx43)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)在37 ℃，二氧化碳(CO2)、氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)80%以上，用0.25%胰酶消化傳代，24 h后換液，48～72 h后再進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞H/R模型建立 用不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基替換原有的完全培養(yǎng)基，將H9c2細(xì)胞置于37 ℃，CO2、氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.21的缺氧培養(yǎng)箱中缺氧處理12 h后，將培養(yǎng)基重新更換為完全培養(yǎng)基并置于37 ℃，CO2、氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理12 h。

1.2.3 分組 將H9c2細(xì)胞分為5組：對(duì)照組正常培養(yǎng)；另4組為處理組，分別為H/R組細(xì)胞按1.2.2方法進(jìn)行H/R處理。GA組用含GA(1 μmol/L)的完全培養(yǎng)基在37 ℃，CO2、氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中預(yù)處理30 min，再按1.2.2方法進(jìn)行H/R處理；3-MA組用含3-MA(5 mmol/L)的不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基缺氧處理12 h，再用含3-MA(5 mmol/L)的完全培養(yǎng)基復(fù)氧處理12 h；GA+3-MA組用含GA(1 μmol/L)的完全培養(yǎng)基在37 ℃，CO2、氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中預(yù)處理30 min，接著用含3-MA(5 mmol/L)的不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基缺氧處理12 h，再用含3-MA(5 mmol/L)的完全培養(yǎng)基復(fù)氧處理12 h。

1.2.4 LDH活性檢測(cè) 將H9c2細(xì)胞按1×104/孔的密度接種于96孔板上，對(duì)照組和H/R組各8個(gè)復(fù)孔，收集每孔的培養(yǎng)液，按照LDH試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)兩組LDH活性。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將5組H9c2細(xì)胞按1×104/孔的密度接種于96孔板上，每組8個(gè)復(fù)孔。另設(shè)空白組，只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞。每孔加入10 μL CCK-8溶液(起始培養(yǎng)基為100 μL)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為0.05的培養(yǎng)箱中孵育1 h。孵育結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A450)。將對(duì)照組細(xì)胞活力定義為100%，處理組細(xì)胞活力(%)=(處理組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)×100%。

1.2.6 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位 將H9c2細(xì)胞按(2～5)×105/孔的密度接種于6孔板上，每組3個(gè)復(fù)孔。用0.25%胰酶消化、離心后加完全培養(yǎng)基重懸。加0.5 mL JC-1染色工作液在37 ℃，CO2、氧氣體積分?jǐn)?shù)分別為0.05、0.21的培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后130×g、4 ℃離心3 min，棄上清液。用JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，在130×g、4 ℃離心3 min，棄上清液，該步驟重復(fù)2次后加500 μL JC-1染色緩沖液重懸，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析。線粒體膜電位高時(shí)JC-1聚合物呈紅色熒光，線粒體膜電位低時(shí)JC-1單體呈綠色熒光，以綠色熒光百分比(線粒體膜電位降低細(xì)胞百分比)表示線粒體膜電位的下降程度。

1.2.7 Western印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)水平 提取各組心肌細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，利用細(xì)胞線粒體分離試劑盒提取各組細(xì)胞中的線粒體蛋白質(zhì)，采用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。每孔40 μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉的TBST(Tris-HCl和吐溫-20)緩沖液室溫封閉2 h后(磷酸化蛋白質(zhì)用1%～3%的牛血清白蛋白封閉)，分別放入抗coxⅣ一抗(1∶5 000)、抗GAPDH、Cx43和p-Cx43一抗(1∶1 000)、抗Beclin-1和LC3B一抗(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜5～6次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h。TBST緩沖液洗膜5～6次，每次5 min，ECL顯影，采集圖像。Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ以GAPDH為內(nèi)參，線粒體Cx43和p-Cx43以coxⅣ為內(nèi)參，用目的蛋白質(zhì)灰度/內(nèi)參灰度表示蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 電子顯微鏡(簡(jiǎn)稱電鏡)觀察自噬體 將H9c2細(xì)胞按(2～5)×105/孔的密度接種于6孔板上，每組2個(gè)復(fù)孔。吸除原培養(yǎng)液，加入2.5%戊二醛固定2 h后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，320×g、離心5 min，2.5%戊二醛重懸，透射電鏡觀察自噬體。

2 結(jié) 果

2.1 H9c2心肌細(xì)胞H/R模型的建立 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，H/R組漂浮的死細(xì)胞較多、細(xì)胞密度降低，見(jiàn)圖1。H/R組的細(xì)胞活力為(85.14±9.01)%，顯著低于對(duì)照組的(100.00±0)%(P<0.01)。H/R 組胞培養(yǎng)液中LDH水平為(163.20±7.26) U/L，顯著高于對(duì)照組的(130.25±24.31) U/L(P<0.01)。H9c2細(xì)胞H/R模型成功建立。

2.2 各組自噬體及其相關(guān)蛋白質(zhì)水平的比較 與對(duì)照組相比，H/R組的自噬體明顯增多，內(nèi)含被吞噬的線粒體等結(jié)構(gòu)；GA組、3-MA組、GA+3-MA組的自噬體均較H/R組明顯減少，其中GA組可見(jiàn)大量腫脹的線粒體， GA+3-MA 組細(xì)胞器損傷嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)模糊，見(jiàn)圖2。 經(jīng)Western印跡法檢測(cè)，H/R組自噬相關(guān)蛋白質(zhì)Beclin-1水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)，GA組、3-MA組、GA+3-MA組的Beclin-1蛋白質(zhì)水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均顯著低于H/R組(P值均<0.05)，GA+3-MA組的Beclin-1蛋白質(zhì)水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ分別顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

A 對(duì)照組 B H/R組圖1 對(duì)照組和H/R組H9c2心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×100)

A 對(duì)照組 B H/R組 C GA組 D 3-MA組 E GA+3-MA組圖2 透射電鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)的自噬體(×5 000)

1 對(duì)照組 2 H/R組 3 GA組 4 3-MA組 5 GA+3-MA組圖3 Western印跡法檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞中 Beclin-1和LC3B蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果

2.3 各組線粒體膜電位的比較 圖4中右下象限代表綠色熒光所占百分比，比較各組線粒體膜電位下降程度發(fā)現(xiàn)，H/R組和對(duì)照組的線粒體膜電位分別下降(14.45±0.84)%和(7.34±0.75)%，H/R組的線粒體膜電位顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；GA組、3-MA組和GA+3-MA組的線粒體膜電位分別下降(27.87±1.68)%、(22.76±1.55)%和(38.88±1.41)%，其線粒體膜電位均顯著低于H/R組(P值均<0.05)；GA+3-MA組的線粒體膜電位顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)。

組別Beclin-1LC3BⅡ/LC3BⅠ對(duì)照0.26±0.030.77±0.09H/R0.89±0.05①4.37±0.50①GA0.75±0.06②③3.29±0.18②③3-MA0.47±0.03②③1.37±0.09②③GA+3-MA0.31±0.02②0.85±0.14②

與對(duì)照組比較：①P<0.05；與H/R組比較：②P<0.05；與GA+3-MA組比較：③P<0.05

A 對(duì)照組 B H/R組 C GA組 D 3-MA組 E GA+3-MA組圖4 各組H9c2心肌細(xì)胞中線粒體膜電位的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.4 各組線粒體Cx43蛋白質(zhì)水平的比較 H/R組的線粒體Cx43和p-Cx43蛋白質(zhì)水平均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)，GA組、GA+3-MA組的線粒體Cx43蛋白質(zhì)水平均顯著低于H/R組(P值均<0.05)，GA組、3-MA組、GA+3-MA組的線粒體p-Cx43蛋白質(zhì)水平均顯著低于H/R組(P值均<0.05)；GA+3-MA組的線粒體p-Cx43蛋白質(zhì)水平分別顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)，見(jiàn)圖5、表2。

1 對(duì)照組 2 H/R組 3 GA組 4 3-MA組 5 GA+3-MA組圖5 Western印跡法檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞中線粒體Cx43和p-Cx43蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果

組別Cx43p-Cx43對(duì)照0.86±0.020.58±0.01H/R0.75±0.03①0.41±0.03①GA0.62±0.09②0.27±0.06②③3-MA0.72±0.040.33±0.05②③GA+3-MA0.59±0.07②0.18±0.04②

與對(duì)照組比較：①P<0.05；與H/R組比較：②P<0.05；與GA+3-MA組比較：③P<0.05

2.5 各組細(xì)胞活力的比較 H/R組的細(xì)胞活力為(91.94±4.77)%，顯著低于對(duì)照組的(100.00±0)%(P<0.05)；GA組[(79.16±7.96)%]、3-MA組[(49.66±10.65)%]、GA+3-MA組[(40.45±3.59)%]的細(xì)胞活力均顯著低于H/R組(P值均<0.05)；GA+3-MA組的細(xì)胞活力分別顯著低于GA組和3-MA組(P值均<0.05)。

3 討 論

本研究中H9c2細(xì)胞在經(jīng)歷H/R后，細(xì)胞死亡增多、密度降低，細(xì)胞活力下降，LDH水平上升，表明H9c2心肌細(xì)胞H/R模型建立成功。

Beclin-1是再灌注階段調(diào)控自噬活動(dòng)的關(guān)鍵因子，LC3B參與自噬體的延伸，LC3B Ⅰ轉(zhuǎn)變成LC3B Ⅱ并定位在自噬體膜上是自噬體形成的標(biāo)志，檢測(cè)Beclin-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ值可反映自噬水平。本研究進(jìn)一步經(jīng)電鏡觀察自噬體的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組Beclin-1水平和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ均升高，電鏡下見(jiàn)H/R組自噬體增多，表明H/R引起心肌細(xì)胞自噬活動(dòng)增加，這與既往報(bào)道一致。與H/R組相比，3-MA組的線粒體膜電位和細(xì)胞活力均下降，表明3-MA抑制自噬,細(xì)胞的損傷和死亡增多，提示自噬對(duì)H/R心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

缺血-再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜上Cx43的重構(gòu)，包括數(shù)量、分布和磷酸化狀態(tài)的改變，并造成心律失常易感性的增加[4-5]，而對(duì)線粒體上的Cx43蛋白，有研究顯示，在經(jīng)歷90 min缺血后豬心肌中線粒體Cx43含量增加，考慮與其降解被抑制有關(guān)[6]。近期的研究[7]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CoCl2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞缺氧3和6 h均引起線粒體Cx43水平明顯升高，線粒體Cx43對(duì)缺氧心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。本研究中，經(jīng)歷H/R過(guò)程后，H9c2細(xì)胞中線粒體Cx43總含量下降，且p-Cx43下降的幅度更大，說(shuō)明復(fù)氧過(guò)程引起線粒體Cx43含量的下降，并造成線粒體Cx43的脫磷酸化。線粒體Cx43的磷酸化狀態(tài)對(duì)維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定有重要意義[8-9]，推測(cè)線粒體Cx43含量下降和脫磷酸化可能是再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制。GA是熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑，作為一種抗腫瘤藥物被廣泛研究，它可引起腫瘤細(xì)胞線粒體通透性增加、膜電位下降，以及細(xì)胞色素C釋放，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。研究[3]結(jié)果表明，GA抑制HSP90介導(dǎo)的Cx43向線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而消除缺氧后處理對(duì)H/R心肌的保護(hù)作用。本研究利用GA抑制Cx43向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)現(xiàn)，與H/R組相比，GA組線粒體Cx43和p-Cx43水平進(jìn)一步降低，并引起線粒體膜電位和細(xì)胞活力的下降，證實(shí)了線粒體Cx43及其磷酸化狀態(tài)的維持對(duì)H/R心肌的保護(hù)有重要作用。

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，自噬參與細(xì)胞膜上Cx43的降解，而在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)Cx43的內(nèi)吞和降解則可導(dǎo)致自噬的增加[13]，但自噬與線粒體Cx43間的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與H/R組相比，3-MA組線粒體p-Cx43明顯減少，但線粒體Cx43水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制自噬后線粒體Cx43脫磷酸化增多，自噬對(duì)線粒體Cx43磷酸化的維持起重要作用。進(jìn)一步比較GA+3-MA組與GA組的線粒體Cx43、p-Cx43水平，更加說(shuō)明這一問(wèn)題。本研究還發(fā)現(xiàn)，與H/R組相比，GA組線粒體Cx43、p-Cx43均較少，自噬水平明顯下降；與3-MA組相比，GA+3-MA組線粒體Cx43總量無(wú)明顯變化，而線粒體p-Cx43減少，自噬活性進(jìn)一步降低，表明線粒體Cx43特別是p-Cx43可能是自噬激活信號(hào)通路中的重要一環(huán)。此外，通過(guò)比較各組線粒體膜電位和細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，GA+3-MA組的線粒體膜電位和細(xì)胞活力下降最為顯著，表明自噬與線粒體Cx43對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)有協(xié)同作用。

綜上所述，自噬參與線粒體Cx43磷酸化狀態(tài)的維持，線粒體Cx43特別是p-Cx43也參與了自噬的激活過(guò)程，它們對(duì)H/R心肌起保護(hù)作用。靶向上調(diào)自噬水平與線粒體Cx43含量，改善線粒體Cx43磷酸化狀態(tài)，可能成為今后治療心肌缺血-再灌注損傷的重要手段。