草莓絲核菌根腐病病原菌鑒定及7種殺菌劑的抑菌作用測(cè)定

尹沙亮 鐘珊 劉奇志 張國(guó)珍

摘要 為了解草莓絲核菌根腐病的病原種類及篩選防治絲核菌根腐病的有效殺菌劑，本研究基于形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞核熒光染色、菌絲融合群測(cè)定以及rDNA-ITS的序列分析，對(duì)北京和河北承德地區(qū)的草莓絲核菌根腐病的病原菌進(jìn)行了鑒定，并利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了7 種殺菌劑對(duì)絲核菌的抑菌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)的絲核菌為雙核絲核菌（binucleate Rhizoctonia，BNR），屬于融合群AG-A;河北的絲核菌為立枯絲核菌Rhizoctonia solani，屬于融合群AG-4。氟啶胺、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺、戊唑醇、咯菌腈、氟硅唑?qū)?種絲核菌均有很強(qiáng)的抑制作用，EC50值為0.063 9～2.485 7 μg/mL，抑霉唑的抑制作用較差，EC50值為9.966 8～11.236 8 μg/mL。同一種殺菌劑對(duì)不同絲核菌的抑制作用存在差異，噻呋酰胺、戊唑醇、氟硅唑、咯菌腈和抑霉唑?qū)α⒖萁z核菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)雙核絲核菌。試驗(yàn)結(jié)果為生產(chǎn)上合理選用殺菌劑防治草莓絲核菌根腐病提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 草莓根腐病; 雙核絲核菌; 立枯絲核菌; 殺菌劑篩選

中圖分類號(hào)： S 436.639

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018351

草莓Fragaria × ananassa Duch.屬薔薇科草莓屬多年生常綠草本果樹，因果實(shí)色澤鮮艷、芳香多汁、酸甜適口，含有豐富的維生素C，被譽(yù)為“水果皇后”[1]。2015年我國(guó)草莓總種植面積已達(dá)到12.93萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量347.9萬(wàn)t[2]。隨著國(guó)內(nèi)草莓種植面積的擴(kuò)大和栽培模式的轉(zhuǎn)變，土傳根部病害加重。已報(bào)道的草莓根腐病的病原菌達(dá)20多種，主要有鐮孢屬Fusarium[3]、炭疽菌屬Colletotrichum[45]、絲核菌屬Rhizoctonia[67]、柱孢菌屬Cylindrocarpon[8]、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis[910]等真菌。其中，由絲核菌引起的草莓根腐病是影響草莓生產(chǎn)的重要病害之一，嚴(yán)重威脅世界草莓的生產(chǎn)，在美國(guó)、澳大利亞、意大利等多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道[7， 1112]。國(guó)內(nèi)對(duì)草莓絲核菌根腐病的研究比較有限，前期報(bào)道的病原菌一般為立枯絲核菌R.solani[1314]。2016年，鐘珊等[15]首次報(bào)道了由雙核絲核菌binucleate Rhizoctonia引起的草莓根腐病在中國(guó)的發(fā)生。

針對(duì)其他作物上的立枯絲核菌，國(guó)內(nèi)已有一些殺菌劑的毒力測(cè)定[1617]。而專門針對(duì)引起草莓根腐病的絲核菌進(jìn)行殺菌劑的毒力測(cè)定鮮有報(bào)道[18]。目前國(guó)內(nèi)引起草莓根腐病的絲核菌種類有哪些，不同絲核菌對(duì)殺菌劑的敏感性是否存在差異并不清楚。針對(duì)此問(wèn)題，我們對(duì)北京和河北省承德地區(qū)的草莓絲核菌根腐病病樣進(jìn)行了分離和鑒定，并測(cè)定了氟硅唑、抑霉唑、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺、戊唑醇、咯菌腈和氟啶胺7種殺菌劑對(duì)代表性菌株的抑菌作用，旨在為草莓絲核菌根腐病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 草莓病樣

2014年-2016年采自北京市昌平區(qū)和河北省承德地區(qū)。

1.1.2 殺菌劑原藥

95%氟硅唑（flusilazole）、96%抑霉唑（imazalil）、97%吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和96%噻呋酰胺（thifluzamide）由北京中植科華農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司提供;95%戊唑醇（tebuconazole）、95.2%咯菌腈（fludioxonil）和98.44%氟啶胺（fluazinam）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室劉西莉教授提供。

1.1.3 絲核菌菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株

雙核絲核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)于金鳳教授提供，立枯絲核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳旭君副教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離：用流動(dòng)的清水清洗草莓病株的根莖和小根。取剖開后有褐色病斑的根莖，在病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊;取有黑褐色病斑的小根，于病健交界處切取5 mm長(zhǎng)的小段。用3.3% NaClO溶液消毒1 min，滅菌水漂洗3次，再用滅菌吸水紙吸干表面水分，置于PDA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)。3 d后挑取從病組織塊長(zhǎng)出的菌絲轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)，從菌落邊緣切取單根菌絲尖進(jìn)行菌株純化。對(duì)純化菌株進(jìn)行編號(hào)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將分離菌株在28℃培養(yǎng)3 d，于菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，置于PDA平板（直徑9 cm）培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)，觀察并記錄菌落顏色，有無(wú)菌核產(chǎn)生等培養(yǎng)性狀，十字交叉法逐日測(cè)量菌落直徑。

1.2.3 菌絲細(xì)胞核數(shù)目觀察

采用插片法培養(yǎng)菌株。菌株接種于PDA平板中央，滅菌蓋玻片斜插在接菌點(diǎn)周圍，菌絲長(zhǎng)滿蓋玻片后取出。參照Xu和Hamer的方法[20]經(jīng)過(guò)優(yōu)化，用熒光染色劑Calcofluor（10 μg/mL）和 Hoechst 33258（1 μg/mL）對(duì)菌絲進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察菌絲細(xì)胞中的細(xì)胞核數(shù)目。

1.2.4 菌絲融合群測(cè)定

采用載玻片對(duì)峙法[2122]：待測(cè)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在28℃，黑暗條件下培養(yǎng)2 d，在菌落邊緣各取菌餅（直徑5 mm），同時(shí)置于涂有2% WA培養(yǎng)基的載玻片上，兩個(gè)菌餅間隔約2 cm。將接菌的載玻片放置在28℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。待兩菌落前沿相遇并交疊約2～5 mm后，取出載玻片于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用CTAB法提取純化菌株的基因組DNA。用通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)分離菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)責(zé)任有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。在NCBI網(wǎng)站下載標(biāo)準(zhǔn)菌株的rDNA-ITS序列（表1），用BioEdit對(duì)供試菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進(jìn)行比對(duì)分析，適當(dāng)人工校正剪切后，用MEGA 6.0 以最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap=1 000。

1.2.6 殺菌劑的抑菌作用測(cè)定

先用二甲基亞砜（DMSO）將供試殺菌劑原藥配成母液（104 μg/mL），之后用DMSO稀釋，制成系列濃度梯度藥液。將殺菌劑加入PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻，制成含藥平板（9 cm），以加入等量DMSO的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌餅（5 mm），每一含藥平板中央接種一個(gè)菌餅，28℃黑暗培養(yǎng)。每個(gè)藥劑濃度重復(fù)3次。當(dāng)對(duì)照菌落長(zhǎng)至直徑約7 cm時(shí)，用十字交叉法測(cè)量含藥平板上的菌落直徑，按下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑×100%。

將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成幾率值（y），藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)（x），得出各殺菌劑的毒力回歸方程y=kx+b，并計(jì)算EC50值及相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離情況

從采集的草莓根腐病病樣中共分離到25株絲核菌菌株，其中從北京市昌平區(qū)的病樣分離到14株，從河北省承德地區(qū)的病樣中分離到11株。分離菌株經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，對(duì)草莓均有致病性（結(jié)果未列出）。

2.2 菌株的形態(tài)特征及細(xì)胞核數(shù)目

分離菌株在PDA平板上均呈輻射狀生長(zhǎng)，菌落較疏松。顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲呈直角或近直角分枝，分枝處縊縮，近分枝處有隔膜，符合絲核菌屬的特征。但不同地區(qū)分離菌株在菌落生長(zhǎng)速度、菌落顏色及細(xì)胞核數(shù)目上不同。北京分離菌株生長(zhǎng)相對(duì)較慢，平均生長(zhǎng)速率為28.7 mm/d（圖1a）;菌絲體初期白色，后呈淡褐色，連續(xù)培養(yǎng)20 d仍不產(chǎn)生菌核;經(jīng)熒光染色發(fā)現(xiàn)菌絲細(xì)胞內(nèi)有兩個(gè)細(xì)胞核（圖1c）。河北分離菌株生長(zhǎng)相對(duì)較快，以38.0 mm/d的平均速率生長(zhǎng)（圖1b）;培養(yǎng)2 d后菌絲在PDA平板上開始糾集，隨后顏色加深，形成黑褐色菌核;菌絲細(xì)胞內(nèi)有3個(gè)以上的細(xì)胞核，多為4個(gè)（圖1d）。根據(jù)菌絲的形態(tài)特征和細(xì)胞核數(shù)目，確定北京菌株為雙核絲核菌binucleate Rhizoctonia，河北菌株為立枯絲核菌R.solani。

2.3 分離菌株的菌絲融合群

根據(jù)待測(cè)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的對(duì)峙培養(yǎng)觀察和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，分離得到的雙核絲核菌菌株均能與菌絲融合群AG-A的標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生菌絲融合（圖2a），而與其他融合群的菌株不發(fā)生菌絲融合（圖2b）;分離得到的立枯絲核菌菌株均能與菌絲融合群AG-4的標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生菌絲融合（圖2c），而與其他融合群的菌株不發(fā)生菌絲融合（圖2d）。測(cè)定結(jié)果表明，本研究從草莓根部分離到的雙核絲核菌為AG-A融合群，立枯絲核菌為AG-4融合群。

2.4 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

用rDNA-ITS通用引物對(duì)ITS1/ITS4對(duì)雙核絲核菌6株代表菌株（MLJ1-2-2、MLJ5-1-2、MLJ6-1-6、MLJ7-1-3、MLJ8-2-2和C1-1-2）和立枯絲核菌4株代表菌株（CD1-1、CD3-1、CD-L4-2和CD-P2-1-1）的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約600 bp的條帶。以Athelia rolfsii（登錄號(hào)：AY684917）為外群菌株，構(gòu)建的雙核絲核菌系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，代表菌株與雙核絲核菌AG-A融合群聚在一支，支持率為99%（圖3a）;以雙核絲核菌AG-A（登錄號(hào)：DQ102421）為外群菌株，構(gòu)建的多核絲核菌的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，代表菌株與立枯絲核菌AG-4融合群聚在一支，支持率為91%（圖3b）。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)一步印證了菌絲融合群的鑒定結(jié)果：測(cè)序的6株雙核絲核菌和4株立枯絲核菌分別屬于AG-A融合群和AG-4融合群。

2.5 兩種絲核菌對(duì)殺菌劑的敏感性

通過(guò)測(cè)定7種殺菌劑對(duì)雙核絲核菌和立枯絲核菌代表菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其中的6種殺菌劑對(duì)兩種絲核菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，EC50值在0.063 9～2.485 7 μg/mL之間。其中噻呋酰胺對(duì)立枯絲核菌的EC50值最低。抑霉唑?qū)煞N絲核菌的抑菌作用較差，EC50在9.966 8～11.236 8 μg/mL之間。同一種殺菌劑對(duì)不同絲核菌的抑制作用存在差異，噻呋酰胺、戊唑醇、氟硅唑、咯菌腈和抑霉唑?qū)α⒖萁z核菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)雙核絲核菌，即立枯絲核菌比雙核絲核菌對(duì)這5種殺菌劑更為敏感（表2）。氟啶胺和吡唑醚菌酯對(duì)兩種絲核菌的抑制作用比較一致，即兩種絲核菌對(duì)這兩種殺菌劑的敏感性比較一致。

3 討論

由絲核菌引起的草莓根腐病是重要的草莓根部病害之一。在國(guó)外，已有不少國(guó)家和地區(qū)對(duì)引起草莓根腐病的絲核菌種類及其融合群進(jìn)行了研究。在美國(guó)加州中部沿海地區(qū)從草莓上分離的123株菌中，除了1株為多核絲核菌外，其余均為雙核絲核菌，包括3個(gè)融合群，即AG-A、AG-G和AG-I[23]。在南非的西開普省，59.3%的菌株為雙核絲核菌AG-A、AG-G和AG-I，40.7%的菌株為立枯絲核菌的AG-6[24]。西澳大利亞州草莓上分離到的96株絲核菌均為雙核絲核菌，具有致病性的菌株屬于融合群AG-A、AG-K和AG-I[25]。而我國(guó)對(duì)引起草莓根腐病的絲核菌研究極為有限。本研究發(fā)現(xiàn)北京和河北承德地區(qū)引起草莓根腐病的絲核菌分別為雙核絲核菌融合群AG-A和立枯絲核菌融合群AG-4。本研究?jī)H對(duì)國(guó)內(nèi)兩個(gè)地區(qū)的草莓根腐病的絲核菌進(jìn)行了鑒定，其他草莓產(chǎn)區(qū)是否存在絲核菌的其他種類以及融合群，還有待于進(jìn)一步檢測(cè)和研究。

通過(guò)測(cè)定7種殺菌劑對(duì)2種絲核菌抑菌作用，發(fā)現(xiàn)除抑霉唑外，其他6種殺菌劑對(duì)測(cè)試的絲核菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，其中氟啶胺、吡唑醚菌酯和噻呋酰胺的抑制作用最強(qiáng)，EC50值在0.063 9至0.426 8 μg/mL。這些殺菌劑可作為生產(chǎn)上防治草莓絲核菌根腐病的候選藥劑。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)同一種殺菌劑對(duì)不同絲核菌的抑菌作用存在差異，有5種殺菌劑表現(xiàn)為對(duì)立枯絲核菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)雙核絲核菌的抑制作用，換言之，立枯絲核菌比雙核絲核菌對(duì)殺菌劑更為敏感。對(duì)于這種差異的原因尚不清楚，也有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：田 喆）