毛維興 李焰 張樹武 薛應(yīng)鈺 徐秉良

摘要 采用菌落生長速率法、分生孢子玻片萌發(fā)法和離體枝條燙傷接種法測定了5種植物源藥劑對蘋果樹腐爛病室內(nèi)防治效果。結(jié)果表明，5種植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌菌落生長和分生孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制作用，當(dāng)0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、20%乙蒜素EC、0.5%小檗堿AS和1.3%苦參堿AS的有效成分濃度分別為3、50、100、50和14.44 μg/mL時(shí)，其對蘋果樹腐爛病菌菌落生長的抑制率分別為98.63%、99.22%、99.22%、100%和79.29%，其EC50分別為0.43、8.78、11.21、13.68和8.11 μg/mL;對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的校正抑制率分別為97.92%、100%、95.83%、77.08%和96.88%，其EC50分別為0.70、8.56、20.39、28.23和8.04 μg/mL。離體枝條保護(hù)試驗(yàn)表明，20%乙蒜素EC有效成分濃度為100 μg/mL時(shí)對離體枝條保護(hù)作用最佳。本研究通過篩選明確了5種植物源藥劑中0.3%丁子香酚SL可作為抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的最佳藥劑，以及20%乙蒜素EC可作為離體枝條保護(hù)作用的最佳藥劑。

關(guān)鍵詞 蘋果樹腐爛病; 植物源農(nóng)藥; 抑菌活性; 防治效果

中圖分類號： S 436

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018369

蘋果是享有“世界四大水果”之一美譽(yù)的世界性果品[1]。近20年來，中國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2011年國內(nèi)蘋果栽種面積達(dá)到217.73萬 hm2，約占世界蘋果產(chǎn)業(yè)總面積的42%，總產(chǎn)達(dá)到3 598.5萬t，約占世界總產(chǎn)量的54.21%，年產(chǎn)達(dá)到1 605.17億元，但年產(chǎn)量還處于世界低水平，蘋果樹腐爛病的大規(guī)模發(fā)生是限制蘋果產(chǎn)量的重要因素[2]。蘋果樹腐爛病主要危害樹體枝干、主枝、果實(shí)等部位，其發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致果樹枝干殘缺、樹勢衰弱、產(chǎn)量下降，甚至出現(xiàn)毀園現(xiàn)象[3]。

當(dāng)前關(guān)于蘋果樹腐爛病的防治手段以使用化學(xué)農(nóng)藥為主[4]。福美胂是化學(xué)農(nóng)藥中最常用的一種藥劑，防治蘋果樹腐爛病效果較好，但長期使用會使環(huán)境和果品被砷污染，且其具有中等毒性、強(qiáng)致敏性及強(qiáng)皮膚刺激性。據(jù)相關(guān)調(diào)查表明，超過30年的蘋果樹和樹盤土壤中砷的殘留量高出國家標(biāo)準(zhǔn)30倍[5]。隨著化學(xué)農(nóng)藥引起的3R問題漸漸被人們關(guān)注，近年來世界各國開始出臺相應(yīng)的政策控制化學(xué)農(nóng)藥的使用。

植物源農(nóng)藥是來源于大自然的天然農(nóng)藥，不會造成藥害殘留，對人畜安全，是代替化學(xué)農(nóng)藥的首選生物農(nóng)藥之一[6]。目前，關(guān)于植物源農(nóng)藥作為殺菌劑的研究還較少[7]。據(jù)趙常安[8]研究表明，0.3%丁子香酚可溶液劑（SL）不僅對馬鈴薯晚疫病起到防治作用，而且具有一定的增產(chǎn)作用。目前有關(guān)植物源農(nóng)藥應(yīng)用于蘋果樹腐爛病防治的研究較少，尤其有關(guān)其作用機(jī)理方面尚未報(bào)道。

基于此，本研究選取了5種植物源農(nóng)藥，采用菌絲生長速率法、離體枝條燙傷接種法和分生孢子萌發(fā)法測定了5種植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌菌落生長的抑制作用和在離體枝條上的保護(hù)作用，以便進(jìn)一步為生產(chǎn)中防治蘋果樹腐爛病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

蘋果樹腐爛病菌Valsa mail由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 離體枝條

采集于甘肅省蘭州市西固區(qū)蘋果園‘新紅星健康枝條，樹齡為20年。

1.1.3 供試藥劑

20%乙蒜素乳油（EC），河南省南陽臥龍農(nóng)藥廠;0.3%丁子香酚可溶液劑（SL），南通神雨綠色藥業(yè)有限公司;5%香芹酚水劑（AS），蘭州世創(chuàng)生物科技有限公司;1.3%苦參堿水劑（AS）， 恒源偉業(yè)生物科技有限公司;0.5%小檗堿水劑（AS），濰坊奧豐作物病害防治有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備

將供試藥劑經(jīng)無菌水按半倍稀釋法[9]配制成如表1所示濃度的藥液，將不同濃度藥劑加入滅菌后冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基，充分振蕩混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，以加無菌水的培養(yǎng)基作為空白對照，待培養(yǎng)基凝固后接種蘋果樹腐爛病病原菌，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，篩選出較好的藥劑設(shè)定濃度進(jìn)行毒力測定（表2）。

1.2.2 不同植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌菌落生長的抑制作用

用打孔器（d=5 mm）從培養(yǎng)7 d 的蘋果樹腐爛病菌菌落邊緣打取菌餅，接種到含藥和空白對照平板中央。以加無菌水的培養(yǎng)基作為空白對照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算生長抑制率。

生長抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5）]×100%。

1.2.3 不同植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌孢子活性的影響

在超凈工作臺上，將5種農(nóng)藥稀釋成不同濃度，制成含藥培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻后，滴入50 μL腐爛病菌孢子懸浮液，用無菌玻璃涂布器將孢子懸浮液涂抹均勻。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，以加入等量無菌水的PDA為空白對照。將涂抹均勻的PDA培養(yǎng)基置于25℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)24 h后切取1 cm2大小的正方形培養(yǎng)基放于載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)狀況。每個重復(fù)選擇100個孢子檢查萌發(fā)率。計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率。

孢子萌發(fā)率=（萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)）×100%;

萌發(fā)抑制率=[（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率]×100%。

1.2.4 不同植物源藥劑對接種病原菌的離體枝條保護(hù)作用

參照翟慧者[10]和臧睿等[11]離體枝條接種方法，截取10 cm長的離體枝條，先用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗，接著用脫脂棉蘸取酒精對枝條表面進(jìn)行消毒，最后置于超凈工作臺晾干后燙傷，再次噴無菌水晾干，將已配制好的不同濃度藥劑涂抹于傷口，待晾干后接種培養(yǎng)5 d的蘋果樹腐爛病菌菌餅，以先涂抹無菌水后接種病原菌為對照。試驗(yàn)每個處理和對照接種3個枝條，每個枝條2個接種點(diǎn)，每處理共計(jì)6個接種點(diǎn)（即為6次重復(fù)）。保濕培養(yǎng)7～10 d后采用“十字交叉法”測量病疤長度和短徑，并計(jì)算病疤面積。

病疤面積（cm2）=1/4×π×長徑×短徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并采用SPSS 19.0軟件和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的抑制作用

通過含藥培養(yǎng)基法測定植物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，5種植物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長均具有一定的抑制作用。通過菌絲生長抑制率計(jì)算5種藥劑EC50，得出0.3%丁子香酚SL EC50 最低，僅為0.43 μg/mL;而0.5%小檗堿AS EC50最高，為13.68 μg/mL。因此，0.3%丁子香酚SL對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長抑制作用最為顯著（表3）。

2.2 不同植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

不同植物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)均有一定的抑制效果，通過不同藥劑EC50得出： 丁子香酚對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0. 70 μg/mL;苦參堿和香芹酚次之，EC50分別為8.04 μg/mL、8.56 μg/mL;乙蒜素的抑制作用較差，EC50為20.39 μg/mL;小檗堿對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最差，EC50為28.23 μg/mL（表4）。

2.3 不同植物源藥劑對接種病原菌的離體枝條保護(hù)作用

結(jié)果表明，供試的5種植物源藥劑對接種蘋果樹腐爛病菌的離體枝條均有不同的保護(hù)效果。20%乙蒜素EC對接種病原菌的離體枝條的保護(hù)作用顯著高于其他藥劑，病疤面積最小，為160.21 mm2，與對照相比差異顯著;5%香芹酚AS、0.3%丁子香酚SL和1.3%苦參堿AS次之，病疤面積分別為236.03、266.42和484.95 mm2;0.5%小檗堿AS在接菌后對離體枝條的保護(hù)作用最弱，病疤面積最大，為597.09 mm2，而對照的病疤面積為1 309.64 mm2（圖1和表5）。

3 結(jié)論與討論

3.1 植物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病菌菌落及孢子萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)供試的5種植物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病菌的菌落生長和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用。隨著不同藥劑濃度的增加，其抑制效果顯著增強(qiáng)，其中0.3%丁子香酚SL對蘋果樹腐爛病菌菌落生長和孢子萌發(fā)的抑制率最高，其EC50分別為0.43 μg/mL和0.70 μg/mL;其次為1.3%苦參堿AS，抑制菌落生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為8.11 μg/mL和8.04 μg/mL。楊勇等[12]的研究發(fā)現(xiàn)20%丁子香酚AS對葡萄灰霉病有較好的抑菌效果，濃度為50 μg/mL時(shí)抑制率達(dá)到93.47%，且與另一植物源農(nóng)藥5%苦參堿混配后，對葡萄灰霉病菌的抑菌活性顯著增強(qiáng)。同時(shí)，安永學(xué)等[13]的研究表明5%的香芹酚AS 500倍液對辣椒白粉病的防效可達(dá)89.93%，且可使辣椒增產(chǎn)18.08%;郭成瑾等[14]的研究表明在大田試驗(yàn)中使用0.3%丁子香酚SL防治馬鈴薯晚疫病，在發(fā)病初期噴施2～3次，防病效果可達(dá)72.17%。本試驗(yàn)表明，丁子香酚對蘋果樹腐爛病具有較好的防治效果。

3.2 植物源農(nóng)藥對蘋果離體枝條的保護(hù)作用

離體枝條試驗(yàn)結(jié)果表明20%乙蒜素EC對蘋果離體枝條的保護(hù)作用最強(qiáng)，接種蘋果樹腐爛病菌7 d后，病疤面積最小，為160.21 mm2。據(jù)報(bào)道，葉面噴施乙蒜素不僅能夠促進(jìn)作物生長，還對作物的枯萎病和蔓枯病具有較好的防效[15]。楊淑貞等[16]的研究表明，80%乙蒜素EC可用于防治山核桃干腐病，乙蒜素可以抑制山核桃干腐病病原菌菌絲生長，同時(shí)對山核桃木質(zhì)部具有良好的保護(hù)作用，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

利用植物源制劑防治植物病害是目前植物病害生物防治的一個新領(lǐng)域，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥無毒、無殘留、無污染的一個有效途徑，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)。本研究經(jīng)過室內(nèi)試驗(yàn)表明，0.3%丁子香酚SL為供試5種藥劑中抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的最佳藥劑，20%乙蒜素EC為離體枝條保護(hù)作用的最佳藥劑，但是其在實(shí)際生產(chǎn)中對蘋果樹腐爛病的防治作用還有待大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）