辣椒膠孢炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

曾泉 滿益龍 陳岳 張鑫 張卓 李成剛 杜嬌 張德詠 劉勇 譚新球

摘要 由辣椒膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides導(dǎo)致的辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的真菌病害之一。本文以辣椒膠孢炭疽菌CSLL11為供試菌株，采用PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將含有潮霉素B抗性基因和eGFP表達(dá)基因的DNA片段成功轉(zhuǎn)入辣椒膠孢炭疽菌的原生質(zhì)體中，獲得了穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)化子，從而成功建立了辣椒膠孢炭疽菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗結(jié)果表明，可有效篩選陽性轉(zhuǎn)化子的潮霉素B濃度為500 mg/L;PCR及Southern blot結(jié)果顯示，eGFP表達(dá)基因已單拷貝整合至辣椒膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)化子的基因組中;使用熒光顯微鏡觀察第一代及繼代培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化子，菌絲與分生孢子均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光信號，說明GFP能在轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定遺傳;將轉(zhuǎn)化子與野生型菌株相比，菌落形態(tài)、生長速率及致病力水平無明顯差異。本研究建立了辣椒膠孢炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系并獲得了穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化子，對辣椒炭疽菌與寄主互作的研究及病害防治具有重要意義。

關(guān)鍵詞 辣椒炭疽病菌; 遺傳轉(zhuǎn)化; GFP; 生長; 致病性

中圖分類號： S 436.418

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019037

辣椒為茄科辣椒屬的一年生草本植物[1]，是我國種植面積最大的蔬菜作物之一，目前種植面積已經(jīng)超過146.7萬hm2[2]。辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的真菌病害之一，分布廣，危害重，傳播快，可引起辣椒幼苗死亡、落葉和果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)[35]。

辣椒炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，屬于半知菌亞門刺盤孢屬真菌[6]。類似于其他真菌，炭疽菌在冬天或者環(huán)境脅迫條件下能產(chǎn)生大量的微菌核在土壤中休眠，待條件適宜時，微菌核產(chǎn)生大量孢子，經(jīng)過雨水傳播到寄主表面，一旦孢子接觸寄主后，萌發(fā)形成附著胞，病原菌借助其巨大的膨壓穿透寄主表皮，然后在寄主細(xì)胞內(nèi)形成侵染菌絲再擴(kuò)展到相鄰細(xì)胞，形成病斑，同時在病斑上產(chǎn)生大量的孢子，開始下一輪的侵染[7]。盡管炭疽病菌的侵染循環(huán)已然明了，但由于炭疽菌種類繁多，同屬不同種的炭疽病菌間生物學(xué)性狀差異巨大，膠孢炭疽菌各寄主?；团c相應(yīng)寄主間的互作機(jī)制復(fù)雜，因此辣椒膠孢炭疽菌的致病機(jī)理還不清楚，其與寄主的互作機(jī)理尚不明確，因此，有必要針對辣椒膠孢炭疽菌建立一套有效的研究體系。遺傳轉(zhuǎn)化是研究病原菌生長發(fā)育與致病分子機(jī)制的基本方法和手段。在前期對炭疽菌的研究中，包括PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)[89]、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化技術(shù)[1011]，以及電穿孔轉(zhuǎn)化法[12]在內(nèi)的遺傳轉(zhuǎn)化操作已得到廣泛的應(yīng)用，但是由于膠孢炭疽菌各寄主?；烷g培養(yǎng)性狀方面存在較大差異，因此以上轉(zhuǎn)化體系在辣椒炭疽病菌上還未得到成功應(yīng)用。因此，建立一套高效、穩(wěn)定的辣椒炭疽病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，有助于進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)、致病分子機(jī)理以及挖掘潛在的藥劑分子靶標(biāo)，為辣椒炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

辣椒炭疽病菌菌株CSLL11分離自湖南省長沙縣榔梨鎮(zhèn)，采集典型癥狀標(biāo)本，經(jīng)單孢分離，病原鑒定后保存?zhèn)溆谩：泵顾谺抗性的質(zhì)粒SK1044由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉永鋒研究員饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：購自索萊寶Solarbio公司制備的不含抗生素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，46 g于1 L ddH2O，溶解，121℃高壓滅菌20 min。

TB3培養(yǎng)基：酵母提取物3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5 g/200 mL（m/V）。

1.1.3 試劑

裂解酶（lysing enzyme）、聚乙二醇（PEG）和潮霉素（hygromycin B）購自美國Sigma aldrich公司。

1×STC緩沖液：蔗糖100 g，Tris-HCl（50 mmol/L） 3.028 5 g（pH=8.0），CaCl2（50 mmol/L）2.774 5 g;加ddH2O至500 mL，121℃高壓滅菌20 min。

PTC緩沖液：稱量PEG 4000 120 g，溶解于1×STC緩沖液中，定容至200 mL，121℃高壓滅菌20 min。

5×YEG：酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，加ddH2O溶解，定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

酶解液配制：細(xì)胞壁破壁酶0.3 g，完全溶解于0.7 mol/L NaCl后定容至30 mL，用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾除菌。

1.2 辣椒膠孢炭疽病菌對潮霉素的敏感性測定

將辣椒膠孢炭疽病菌菌株CSLL11接種在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，用打孔器沿菌落邊緣打取菌絲塊，轉(zhuǎn)接到潮霉素濃度分別為0、100、200、400 mg/L和600 mg/L的PDA平板上， 26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察生長情況，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 辣椒膠孢炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1 原生質(zhì)體的制備

培養(yǎng)由單個分生孢子再生的菌落，切取菌絲塊于PDA平板上生長1～2 d，切取菌絲塊，盡量切碎，置于約80 mL 5 × YEG的液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h;用1～2層Miracloth過濾收集菌絲，無菌水沖洗兩遍，用吸水紙將殘留水分吸干，將菌絲置于盛有25 mL酶液的50 mL離心管中酶解。離心管水平放置，30℃、60 r/min振蕩1.5～2 h酶解;向酶解液內(nèi)加少許0.7 mol/L NaCl溶液，輕輕搖晃，使用三層滅菌擦鏡紙過濾，用0.7 mol/L NaCl溶液輕輕沖洗1～2次，去殘渣，收集濾液于50 mL離心管中，3 600 r/min、4℃離心10 min;小心棄上清，加10～20 mL 1×STC懸浮沉淀，用剪去尖頭的槍頭輕輕吹打，然后3 000 r/min、4℃離心5 min，重復(fù)上述步驟兩次，加適量（約300 μL）1×STC溶液懸浮，計數(shù)，使原生質(zhì)體終濃度為108個/mL，分裝為150 μL/管，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。

2.4 GFP轉(zhuǎn)化菌株及野生型菌株的生物學(xué)特性差異

2.4.1 GFP轉(zhuǎn)化菌株及野生型菌株的生長情況

采用菌餅法檢測菌株生長速率，并利用搖菌法進(jìn)行產(chǎn)孢量試驗。試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株菌落形態(tài)及生長速率無明顯差異（表1）。轉(zhuǎn)化菌株平均產(chǎn)孢量為0.8×105～1.8×105個/mL，野生型菌株的產(chǎn)孢量為0.8×105～1.4×105個/mL，沒有明顯差異。

2.4.2 GFP轉(zhuǎn)化菌株的致病性測定

以5×105個/mL 分生孢子接種辣椒果實(shí)進(jìn)行致病性測定，接種6 d后調(diào)查致病情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化菌株及野生型菌株接種的辣椒均出現(xiàn)向內(nèi)凹陷的病斑，而未接種病原菌的對照未發(fā)?。▓D6）。

3 討論

PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便、體系成熟等特點(diǎn)，在稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌等絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用非常成熟[1314]，在楊樹、蘋果、梨炭疽菌的遺傳操作中也有報道，但是在辣椒炭疽病菌中還未報道。膠孢炭疽菌寄主繁多，病菌根據(jù)寄主范圍而分化為各種類型，各?；烷g培養(yǎng)性狀、形態(tài)及致病力水平存在較大差異。本研究在前期膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對辣椒炭疽病菌的轉(zhuǎn)化條件摸索優(yōu)化，通過PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法把含GFP序列的DNA片段轉(zhuǎn)入到辣椒炭疽菌中，并且獲得穩(wěn)定的綠色熒光表達(dá)菌株，從而在辣椒炭疽菌中成功建立了高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

原生質(zhì)體的制備在辣椒炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化的過程中起著關(guān)鍵作用，其質(zhì)量和數(shù)量直接影響轉(zhuǎn)化的效率，而菌株專化型、菌株培養(yǎng)時間等因素均決定著原生質(zhì)體的質(zhì)量。辣椒炭疽菌在固體平板及液體培養(yǎng)條件下均易產(chǎn)生分生孢子，當(dāng)大量分生孢子混雜在原生質(zhì)體中時，不僅會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低，還會影響轉(zhuǎn)化子的再生。在梨炭疽病菌中，分生孢子在CM液體培養(yǎng)基生長至24 h后，繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的CM液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培24 h[9]，而本研究縮短了培養(yǎng)時間，新鮮菌絲塊置于5×YEG的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16 h后即用于轉(zhuǎn)化，從而避免了分生孢子對轉(zhuǎn)化過程的影響。

目前，真菌遺傳操作過程中的選擇標(biāo)記有潮霉素、博萊霉素、G418等，為真菌的基因轉(zhuǎn)入、敲除提供了多種選擇[1516]。本研究在尚不明確辣椒炭疽菌對潮霉素B敏感性的前提下，首先開展了潮霉素B的敏感性測定，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)潮霉素B濃度為500 mg/L時，能顯著抑制辣椒炭疽菌的生長，表明此濃度適合作為遺傳轉(zhuǎn)化選擇濃度。

本研究所用的轉(zhuǎn)化片段以農(nóng)桿菌質(zhì)粒SK1044為模板擴(kuò)增獲得，含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白GFP及來源于異旋孢腔菌的強(qiáng)啟動子GPDh，目前SK1044表達(dá)載體多在鐮刀菌中使用[17]，本研究首次在辣椒炭疽菌中使用了該啟動子，獲得的轉(zhuǎn)化菌株熒光強(qiáng)度高且較一致，說明GPDh啟動子可以在辣椒炭疽菌中高水平啟動目的基因的表達(dá)。此外，本研究轉(zhuǎn)化過程中使用的是含有T-DNA上下臂、GFP基因及hygR基因的DNA片段，相比轉(zhuǎn)化質(zhì)粒更加方便且陽性率達(dá)到了100%。

在辣椒炭疽病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系成功建立的同時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子通過3代培養(yǎng)仍可以表達(dá)出明亮綠色熒光，說明GFP基因已整合至轉(zhuǎn)化子基因組中并且能夠穩(wěn)定遺傳。同時，考慮到PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有隨機(jī)插入的特點(diǎn)，我們對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了Southern blot驗證，所選的6個轉(zhuǎn)化子均為單拷貝插入，單拷貝插入比例達(dá)到100%。在對其生長和致病過程中的研究發(fā)現(xiàn)，盡管轉(zhuǎn)入了外源片段，但是轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)表型與野生型較為一致，表明轉(zhuǎn)入的GFP片段并不影響辣椒炭疽菌自身的生長發(fā)育，因此可用于后續(xù)研究辣椒炭疽菌與寄主互作關(guān)系。

本研究摸索了辣椒炭疽病菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化條件，建立了高效、穩(wěn)定的PEG-CaCl2介導(dǎo)的辣椒炭疽病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過轉(zhuǎn)入綠色熒光表達(dá)基因獲得帶有綠色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)化菌株，并且其生長形態(tài)、生長速率及致病性與原始菌株沒有差異，該結(jié)果將為挖掘辣椒炭疽病菌致病相關(guān)基因提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，從而為后續(xù)的辣椒炭疽菌與寄主互作的機(jī)制研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）